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1、用Image-Pro Plus(IPP)分析免疫组化图片,1.免疫组化图片分析原理,根据染色染料颜色的深浅(光密度)及分布面积大小来确定目标蛋白的量。染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量的定量关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。,1.1光密度与灰度迷惑人的不同概念,光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与染色物质的量相关的。灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子照片上像素的亮度称为灰度。,Gray:between white and black,Example:1.The bright value
2、 on display screen is gray value.2.The dark value on a white paper is also the gray value.,Optical Density:吸收光线的物质的光学密度.,被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。OD值与物质的量直接相关，灰度值与OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用0-2.0或者0-3.0。,用OD值是正确的,分光光度计与酶标仪的测定值是OD值透射的显微镜图象上的光强度要用OD值蛋白电泳条带的测量也是OD值。萤光显微
3、镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度(Fluorescence intensity)用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映着荧光物质的多少。Western Blot条带的测定也要使用OD值来进行定量.,处理照片时用的却是灰度,各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时，是对照片的灰度进行测量和计算的。但最后得到的结果还是需要换算回OD值来表达。所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个OD值，光密度。不应该是灰度。准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度值。,
4、用标准样品才能把OD值与样品量关联到一起,OD值是一个没有单位的相对值。使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电泳条带进行定量分析时一样要作标准曲线。电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线亦有很大误差，因此只能说是半定量分析。在实际应用时,可以直接测量OD值,用以表达染色物质的相对的量.,1.2定量分析的指标：IOD(Integrated option density)与density,将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。此值与目标物质的总量成正比。IOD值除以目标分布区域的面积，得到平均den
5、sity，此值反映了目标物质的单位面积浓度。对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比较它们之间的平均光密度值的大小。,1.3比较两张照片的染色物质量的差别,两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大,比较两张照片的染色物质量的差别,两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大,这回该怎么看？,A的颜色深，面积小。B的颜色浅，面积大。,比较体积！,面积,光密度,1.4 实际图片的情况很复杂的。,阳性样品染色深，阴性样品染色浅。,直接比较整张图片的IOD等于在比较整张图片的mean density,哪一个染色物更多？,染色区域颜色接近，染色面积有差异。,使用不同的area会得到不同的结论要结合病理情况来
6、判断。,IOD对整张图片的面积作平均。IOD对特定组织区域面积作平均。IOD对显色的组织区域作平均。,对整张图片区域进行平均的情况比较少,右上角的空白应该扣除。,也许应是这个特定的组织区域,这个区域是染色的区域。往往在计算IOD时同时计算出来，但以此为平均面积往往并不正确。,对单个细胞的分析比较,单个细胞的IOD单个细胞的mean density,边界不清晰的贴壁细胞,整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多，数起来不费事）,细胞簇的分析,测量整张图片黄色区域IOD。再测量细胞分布的区域面积 area。对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。以 IOD/（N*area）作为统计指标。,2.从
7、图片上分析光密度方法 的技术发展,简单测量整张照片的光密度值。在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。计算其平均值作为整张照片的光密度值。在照片上准确选择被染上染料的特定颜色的区域，计算这些区域的累积光密度值（IOD），进而计算统计区域的平均光密度值。,2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪,其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片的整体光密度。可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。,2.2 抽样测量光密度,在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较染色深浅的指标。,随机选取
8、几个区域但是能作到“随机”吗？,2.3 ImagePro plus(IPP)的独特优势。,准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI(area of interesting)。测量这个区域的光密度参数。,使用IPP比前两种方法更好。,在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的图象分析方法及图象分析程序的。,3.用IPP分析免疫组化图片过程,选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。测量该区域的IOD。选择并测量有效统计区域的面积计算选择区域内
9、的光密度平均值IOD/area（density mean）计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。用统计学方法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著性差异。,3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍摄,与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的显微镜照片有其特殊的拍摄要求。,显微镜光源,正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清晰.不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行
10、。6%的灰度滤光片会导致色彩失真。如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从而使得测量结果不准确。,固定显微镜的工作条件,不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上拍摄照片。为保证显微镜光源的稳定一致，所有照片应该一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光源亮度的稳定。,应该使用手动控制曝光的相机,对每张照片要使用相同的曝光时间，而不是由相机自动控制曝光。染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。,控
11、制相机曝光时间,要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方呈现纯亮的白色。拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰度值应达到230左右。可以使用图象分析软件测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图像分析数值的偏差。把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上调节100%透射。,背景的影响,左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD值。而且影响到了阳性区域的色调。,较暗的背景值对分析测量的影响,显著性差异,无显著性差异,扣背景后依然没有显著性差异,注意误差线，依然没有显著性差异,避免使用相机的自动白平衡,自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片
12、进行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色调向蓝色调整,导致色彩的失真.,最好使用专业CCD拍摄,民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片，其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却会改变照片的原始面貌，严重影响照片的分析测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很复杂的设置。不使用自动白平衡校正，但可以使用手动的白平衡校正背景色彩。对所有照片进行统一的背景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。,应当把照片存为无损压缩格式TIFF,特
13、别是对于染色较浅的图片，保存为jpeg格式后会损失亮度细节，导致测量误差增大。要注意相机上直接保存为jpeg的图片就没必要转成TIFF了.,注意那些马赛克,总结拍摄注意事项：,调整显微镜光源亮度，足够白，足够亮。调整相机曝光时间，使背景呈现白色。灰度值最好能达到230以上。确认相机未使用自动白平衡功能。但可以使用手动校正白平衡功能校正背景色彩为纯白色。使用同样的显微镜工作条件与相机工作条件一次拍摄完所有照片。保存照片为TIFF格式。,3.2用Image-pro plus分析免疫组化图片,与photoshop不同，image-pro plus是一个图片分析测量软件。IPP的功能不是用来美化图片，
14、如果照片效果不好或分析结果不理想，要从切片处理与拍摄过程上找原因，而不应试图通过对图片的修饰与处理来解决问题。通过IPP的分析测量只应当准确地反映图片本身的真实测量数据。,3.2.1开始使用IPP,IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含了最常用的一些windows程序的一些通用工具。进入IPP后的第一件事就是打开一幅待分析的图片。,将分析图片信息保存到数据库中,在程序中保存分析图片过程信息是保存实验原始数据的基本原则，必须遵守。将图片信息及图片分析过程及分析的信息存入IPP程序数据库是一种保存实验原始数据的操作。要注意对同一张图片进行同样的操作，由于一些手动的操作无法准确地重复，所
15、以会出现两次同样的测量得到有差异的结果的情况。这也是保存测量结果的理由之一。,3.2.2.设置并保存测量条件,设置光密度校正设置测量项目.设置分色选择参数,3.2.2.1光密度校正方法,校正光密度步骤小结.,1.调出intensity carliberation窗口,点New按纽建立一个新的校正.2.选择std option density,此时可见到反向的校正曲线.3.选择背景空白值对应的灰度.相当于分光光度计中的调整100%透射.4.选择此校正为system carliberation,使之能应用于所有照片.,3.2.2.2选择测量参数,需要测量选择区域的面积(area)与累积光密度(IO
16、D).在测量选项中也有平均光密度这一项,但它不适用于当前的测量,不能选用.选择面积时一般要设置一个过滤值,忽略掉面积过小的点,一般可设置为最小20象素.还要设置一下测量的显示选项(option),一般是选择显示选择区域填充红色.还有一些其他的设置.,选择测量参数,在分析免疫组化图象时,一般是测量选定的具有特定颜色的区域的面积与累积光密度(IOD)对免疫组化的显微照片,一般应分析它的平均光密度.即时IOD/area.根据图象的特点,要分别测量选择区域的IOD及area.对不同的组织照片，要使用不同的测量指标来进行比较。,在count/size里进行这些设置,调出的select Measureme
17、nts,Option设置窗口,保存设置:file save settings,3.2.2.3选取特定颜色所在的区域,一般免疫组化样品中黄色的地方为阳性染色区域。在测量时应当测量这些黄色（棕黄色）区域的光密度值。不测量其他颜色部分的。因此首要的任务就是把这些黄色的区域挑选出来。IPP是利用图片上象素点的颜色分类来选取测量区域的。其选择工具irregular AOI与segmentation是IPP最有特色，最有效的工具。,用IPP选取特定颜色区域的工具,选择特定颜色的区域是IPP最有特色的功能，按照特定的颜色特征选取图象中的特定区域，并计算这些区域的面积等几何尺寸与光密度数据，就是IPP分析图像
18、工作的中心任务。Irregular AOI:适用于选择有明显颜色边界的单个颜色区域。Segmentation：适用于选取整张图片中具有特定颜色的所有区域。测量免疫组化图片一般使用这个工具。,在count/size窗口中点select color,就调出了这个segmentation工具.,点Histogram Based,还要选HIS.,在弹出的警告上点“是”。,H：0-30，S：0-255，I：0-230,设置好的选色条件也要保存的。,测量光密度时，要测量灰度图片,彩色图象上象点的强度是由红蓝绿三色混合而成，如果直接在彩色图上测量光密度，会有一个系统误差。所以正规的测量需要把图象中选取的区域
19、外部分涂白，然后转换图象为灰度图片，再测量光密度。,选择Transparent on White，只显示选择到的区域。再点create preview image复制出一张。,将复制的图片转换成灰度图片。,对此图片再作一次选色，这次只需选择一个强度了。I：0-230,还要保存一次灰度选色设置。,3.2.2.4 好啦，点count进行测量。,看看测量统计数据。,可以把数据存入excel表格里。,3.2.2.5别急，还没完事呢。,以上测量的是选择区域内的累积光密度值IOD，但同时测量的面积却未必是正确的面积。测量数据表里的area是图片上选择的染色区域的面积，这不一定就是我们需要的面积。我们最终要
20、得到的数据应该是一个平均光密度值，是IOD/area。IOD就是前面测量的IOD SUM.但面积是什么则需要认真选择的。,在需要测量整张照片染色的时候，面积就是照片面积。,如果切片只拍摄了一部分，空白处的面积则需扣除。,很多情况下，是要测量某一组织区域内的光密度。,可以使用irregular AOI工具来选择测量区域。,选择一个区域后，点New AOI再选择下一个区域。最后按下图点就行了。,点了convert to object后马上就能看到测量数据。注意这里只有area值有意义。,3.2.3免疫组化照片测量结果的统计分析,一张免疫组化照片一般能得到一个IOD或density值。一张组织切片一般应选择几个视野，拍摄数张照片。这样就有了几个IOD或density值。一个实验对象要作数个组织切片。一组实验数据应包括数个实验切片。这个实验组就有了上百张照片，它们的IOD或density值就构成了这个实验组的测量数据。可以用来进行统计分析。计算平均值与标准差，并与其他实验组进行t-检验等统计处理。可见在进行免疫组化照片的数字化分析时，一般是要拍摄很多张照片的。,
