细胞培养技术-第二讲.ppt

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1、组织培养细胞生命期,原代培养期传 代 期衰 退 期,原代培养期,又称初代培养期（primary culture），从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。,传代培养期初代培养期一经传代后便改称做细胞系cell line。此期为三期中最长，可维持二倍体核型（二倍体细胞系）。当传代3050代后，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止。衰退期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。,传代细胞的生长过程,滞留期（latent phase）细胞接种

2、后，先进入生长缓慢的滞留阶段，包括悬浮期（游离期）和潜伏期。指数增长期（logarithmic growth phase）：又称对数期 此期细胞增殖最为旺盛，细胞分裂相增多，成倍增长，活力最佳。细胞分裂指数（MI），即每1000个细胞中分裂相数。一般MI介于0.10.5。平台期：又称生长停滞期（stagnate phase）此期细胞数量饱和，细胞不再增殖，但仍有代谢活动。,体外培养细胞一代增殖生长过程,第3代BMSCs的分裂指数曲线,接触抑制（contact inhibition）：贴壁生长的体外正常细胞一旦汇合、相互接触后便停止了分裂增殖，不再进入S期，也不会出现交叉重叠生长。恶性细胞无接触

3、抑制现象，所以可将其作为区别正常细胞与癌细胞的标志之一。密度抑制（density inhibition）：培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细胞分裂停止。,传代细胞可连续传710代，细胞形状基本相同，但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁能力，从培养瓶底脱落。,细胞培养的营养条件,水 糖 氨基酸 维生素 无机离子和微量元素 促生长因子,血 清,血清的种类 血清的主要成分及主要作用 血清的使用与储存 影响血清的各种因素 细胞培养中使用血清的缺点

4、,1、血清的种类 胎牛血清：剖腹产的胎牛 牛血清 新生牛血清：出生24h之内的新生牛 小牛血清：出生1030d的小牛（人血清、马血清、羊血清）2、血清的主要成分及主要作用 血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。,A因子：能促进细胞早期生长，缩短潜 伏期，清除细胞内脂肪滴。B因子：是一种脂肪形成剂，易使细胞产 生脂肪滴，其本身是可溶性脂类。B因子在老年血清中含量较多，过滤可除去该因子。C因子：可使细胞发生退化。D因子：可促使细胞粘连，是一种粘着 因子。,去除B、C因子，可促进细胞生长,

5、血清的主要作用,提供基本营养物质 提供贴壁和扩展因子 提供激素及各种生长因子 提供结合蛋白 对培养中的细胞提供某些保护作用,血清的使用与储存,使用前的处理 56灭活30min 去除补体成分 储存条件 灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），20 储存；使用前4 融化。使用浓度 一般为520，最常用的是10。,影响血清的各种因素,年龄：较老动物的血清对细胞生长有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清对细胞生长有利 血色素 胆红质 脂肪酸 血清在培养液中的浓度并非越高越好,细胞培养中使用血清的缺点,使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态。如：血清可以促进成纤维细胞的生长，同时会

6、抑制表皮角质细胞的生长。血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用。如：多胺氧化酶每批血清之间都有差别，其成分不能保持一致。取材过程中有可能带入支原体、病毒，对培养细胞产生影响。,影响细胞生长的因素,温度 渗透压 气体环境和pH 无毒和有毒 辐射线和超声波 细胞接种密度 容器转动速度和悬浮搅动速度,温 度,一般哺乳类及禽类细胞体外培养的适宜温度3738，温度过高或过低都会影响到细胞的生长。,温度对细胞生长的影响,低 温,在低温下，细胞的代谢活力及核分裂降低。温度不低于0 时，虽影响细胞代谢，但并无伤害作用；再把细胞置于2535 时，细胞仍能生存和生长，但速度减慢。若温度过低，在降到冰点以下时，细胞

7、因胞外水和胞质结冰而受损死亡。若向培养液中加入甘油或二甲基亚砜等，封入冻存管，置于液氮中，细胞可耐受70 以下温度，能长期储存，解冻后细胞复苏，仍能继续生长增殖，生物性状不受影响。,高 温,细胞在40数小时后，再置回37 培养，细胞仍能继续生长；但如果在40 下暴露时间太长，对细胞生长不利，甚至变圆脱离瓶底。细胞在3940 培养1h，能受到一定损伤，但仍有可能恢复，但不能忍受温度再升高2，持续数小时，即在4142 中培养1h，细胞损伤严重，温度至43 以上时细胞多数被杀死。高温主要引起酶的灭活、类脂质破坏、核分裂的破坏，产生凝固酶使细胞发生凝固，另外使蛋白质变性。,气体环境和pH,氧（O2）参

8、加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95空气加5二氧化碳的混合气体环境中。,二氧化碳（CO2）,CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（H

9、epes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。,培养细胞的基本特征,一、培养细胞的生长方式和类型,粘附型细胞：附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。如：成纤维细胞、心肌与平滑肌细胞、表皮细胞、骨与软骨细胞、肿瘤细胞悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。如：血、脾及骨髓培养的细胞及某些癌细胞,体外培养细胞的分型,（一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：,1、成纤维细胞型：胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形

10、核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中

11、央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,3、游走细胞型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,

12、游走型细胞,本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细腻包形态。常见于羊水细胞培养的早期。,4、多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,多形型细胞,培养细胞的形态不稳定，可因各种因素而发生改变，如pH、细胞密度、污染等因素。HeLa细胞：血清 高血清成纤维样细胞 低血清上皮样细胞 pH 标准pH上皮样细胞 太酸或太碱成纤维样细胞 细胞密度 低密度成纤维样细胞 高密度上皮样细胞 转化与

13、否 未转化成纤维样细胞 转化后上皮样细胞,粘附型细胞,（二）悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞也可能特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),Hepatocytes,组织培养细胞一代生存期：所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成

14、为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：,培养细胞的生长和增殖过程,单个细胞的细胞周期（cell cycle）,生长增殖过程,间期DNA合成期,组织培养细胞生命期,原代培养期传 代 期衰 退 期,体外培养细胞一代增殖生长过程,1潜伏期（Latent Phase）：细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴

15、壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，1030分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存

16、在于细胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。,初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,原因:操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤 接种细胞:适应，恢复，积累(代谢中间产物)组织块:细胞迁移出一般经数小时-几天,过程:游离:悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁潜伏期:可有运动活动,

17、基本无增殖,少见分裂相,影响因素：滞留期的长短与：细胞种类、按种的细胞密度、培养条件等因素有关。,1.细胞密度接种分散细胞,接种的密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长2.细胞类型传代培养的细胞之潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为6-24h;原代24-96h或更长单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢连续细胞系与发生恶性转化的细胞(6-24h)比有限细胞系与正常二倍体细胞的短来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长成体:长,3.细胞机能状态 不良者慢4.培养条件 培养液,pH,底物 不利:污染,有

18、毒,2指数增生期（Logarithmic growth Phase）：这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。,在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contac

19、t Inhibition）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。,特点：是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段培养物中细胞数量呈指数增长,细胞群体均一是理想的实验用细胞,判断细胞生长的指标：指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标1.有丝分裂指数(MI):指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞

20、。一般细胞的MI约为0.10.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。,判断细胞生长的指标：2.细胞群体倍增时间:培养物中细胞数量翻倍的平均时间3.MTT法：反映细胞内一种酶活性程度4.标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：反映DNA,3停滞期（Stagnate Phase）：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚

21、（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,概述 细胞铺满后再1-2倍增,进入细胞达饱和密度,可存活仍有代谢活动，但基本不分裂，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞,特点(1)细胞数量：细胞达饱和密度，出现密度抑制。停止生长原因:细胞数量多、生长地区占满、营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长。即使经常更换培养液，细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡唯有进行传代方可缓解。,(2)细胞活动小,细胞膜的活动小(3)生长组分下降:010%(4)及时传代：

22、细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况,体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。,体外培养细胞的种类,（一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,（二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为

23、有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。,（三）细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）,（四）二倍体细胞 细胞

24、群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。,（五）遗传缺陷细胞 从有先天

25、遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,（六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传

26、代，每次接种3105细 胞毫升。,细胞系或株的鉴定、管理和使用,ATCC入库细胞要求检测项目如下：培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻 存 液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量,细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性 核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无 无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测 免疫检测：一两种血清学检测

27、细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名,细胞系或株的鉴定、管理和使用,生物学特点,体外培养物的细胞生物学特点,总的：与体内仍有相似-体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系但有不同 相对孤立、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显,体外培养物的细胞生物学特点,与体内仍有相似-体外培养的细胞 仍存在细胞和细胞、细胞和基质 的相互关系 体外培养 单个细胞也能生存和增殖 但单个细胞不是细胞永久存在的形式,培养的细胞之间仍有在形态和机能上的 相互依存关系,1.培养的细胞之间 仍有在形态和机能上的相互依存关系。在结构上，如：上皮细胞仍见有桥粒 在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖,但

28、不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息的结果 2.培养的细胞和基质之间 对细胞外基质仍有依存性,但有不同 人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全 相同 当细胞被置于体外培养后 久了,必然发生变化与体内主要不同 相对孤立、相对单一 缺乏体内的一些影响,主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞纤维化 分化减弱或不显 出现类似“返祖”现象：细胞趋向单一化 或获得不死性 或变成具有恶性性状的细胞群 因此要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体,培养细胞的主要的生物学特点,1.去分化2.贴壁和铺展3.接触抑制和密度依赖性,去分化,细胞分化是指在

29、个体发育过程中，细胞在形态、结构和功能上的特化过程。对个体发育而言，细胞分化得越多，说明个体成熟度越高.只有通过细胞分化,才能形成各种不同的细胞,进而形成不同的各具功能的器官,使生物体成为一个个体,否则假如细胞只是长大变多也就是说只有干重的增加而不分化,所有的细胞都只能保持原始的干细胞的状态也就无法形成生物体了,体外培养物的细胞生物学特点,体外培养生长生物学特征具有两重性 基本生物学特征 仍与体内的细胞相似 培养物在体外条件下生长，许多生长生物学行为发生改变,培养细胞分化状态的变化,体内细胞-三方面的影响与调节:体外环境的影响 体内神经体液因素 的调节 细胞与局部微环境的相互作用 控制-维持着

30、细胞的分化特征。体外培养时，失去了-分化特征逐渐减弱,去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性 如:培养的成纤维细胞 在适当刺激下，可分化为 其它结缔组织细胞和肌组织细胞，表现出类似未分化的间充质细胞的特性，返祖 有2点,1.但去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态如:高度分化的神经细胞和心肌细胞 已经丧失的增生活性不可能恢复 但已经具备的生物电活动特性 不会完全失去,2.可重新表现出分化特点 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成 含大量角蛋白丝的角质细胞 内皮细胞-但，这种能力会随着培养时间延长 逐渐丧失总之，休外培养,使细胞 结构与功

31、能上的“可塑性”增大 防止去分化,贴附和铺展,贴附(粘附)和附着,粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后 耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的生长表面 是细胞能否成功粘附的主要因素。,不同细胞的粘附能力不同 如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强 能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面 如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱 需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞-粘附能力弱的细胞-可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞,细胞形态因是否贴附于底物而不同悬

32、浮的细胞:基本圆形粘附和贴壁的细胞:扁平圆形 相差显微镜“亮圈”很快过渡-,贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着伸展,影响因素 各种细胞不同 如接种30后第二瓶30(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞血细胞(最弱)生物因素 血清、培养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素因素 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着,措施（因素）1.包被对分化程度高、生长能力差的细胞 可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和 生长的生物活性物质 如:-通过其所带电荷先吸附-,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够 促进细胞粘附的成分 细胞本身也可能产生一些粘附分

33、子,措施2.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,铺展,铺展（伸展）(spread)进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为 圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞 极性细胞就是各种有机体细胞 在体外的特征性 细胞形态,铺展状况 是调节细胞形状的主要方面 铺展得越好，细胞越扁 意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展

34、状况 与细胞的生长有密切关系 只有当细胞铺展到合适的程度 DNA合成才开始进行 通过比较贴壁依赖性细胞 不同铺展程度与DNA合成率之间的关系 发现细胞越扁(厚度越小)DNA合成率越高,细胞形状(伸展)与细胞的生长 合适的细胞形状-伸展 对正常细胞的DNA合成重要 对其生长重要,伸展的意义,实验一 成纤维细胞1.附着于玻璃或塑料底物:细胞增殖2.悬浮培养:细胞不增殖3.a.培养在悬浮的玻璃纤维上:若够长:细胞可增殖 若短于20um,细胞可附着,但增殖很慢 或不增殖 b.在某些塑料上:有些细胞可附着,但增殖很慢或不增殖,伸展的意义,原因分析在1.附着培养物上:细胞很扁平,很伸展在2.悬浮培养中:细

35、胞圆球形,未伸展在3.培养中:细胞维持介于扁平与圆球之间因此,细胞形状,至关重要伸展至原来的形态,才能增殖,伸展的意义-实验,伸展的意义-实验二,PolyHEMA 35-0.0035 um 高浓度（厚）低浓度（薄）细胞 圆 扁（附着最差）甲基丙烯酸羟乙酯 获得细胞构型（模型）不同伸展程度的细胞PolyHEMA 细胞厚（2122 um）（伸展差）（10+-2）薄（2 um）（伸展好）（46+-13）,PolyHEMA Cell Height(um)H3(C.P.M).1.00 22 7+-5 4 x 10-2 15 50+-5 4 x 10-3 6 250+-15,细胞悬浮在培养液中时，近似球体

36、形状 当接触坚硬平面 即铺展于底物上，扁平状 与底物形成很多接触点,伸展过程,(1)开始阶段 开始附着铺开 细胞附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足,伸展分几个阶段,(2)放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起伪足形状 主要 柱形丝状:直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状:厚0.1-0.5 宽2-5 尚有:小泡状叶状:直径1-2 开始时:絲状多 以后 片状增加,许多伪足 形成薄的胞质小片牢固贴于底物 胞体中央部分 扁 整亇细胞扁平(3)极化阶段,细胞最后伸展附着的情况 实验：用多种细胞，以显微操作及缩时电影 定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况 检

37、测-显微针头 结果：附着规律,附着点：附着规律几乎未见于细胞的中央区(如不在核之下)总在边缘，边缘”摆动”活动的部位 凸的边缘 在薄的边缘 附着区：约为细胞下面表面的15-35,附着、伸展的条件底物 细胞能在很多固体表面附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如Fn，胶原，聚赖氨酸,接触抑制和密度依赖性,接触抑制和密度依赖性生长仰制,运动的接触抑制,密度依赖性生长仰制,增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，5d细胞

38、计数 于加入10、20、30牛血清的 培养液中，结果：,增殖的密度抑制结果：10血清：20hr后铺满(汇合confluent)以后至5d 细胞数不再增加(细胞 数约1066cm皿)密度抑制 30%血清：以后经常换液至5d，细胞密度继续增加(可达6xl066cm皿)说明:密度抑制-铺满后 不再增殖(分裂停止)血清可降低密度抑制,只加入于3T3停止生 长的培养液中 细胞不生长 当再加入血清 细胞又生长说明血清可消除密度抑制,(2)转化细胞的密度抑制降低 用此培养液 3T3细胞不再分裂增殖 当再加入10血清，3T3细胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制 但当用此培养液，于转化的3T3细胞(SV3T3)

39、却生长良好 表示转化细胞密度抑制降低(血清需要降低)说明：转化细胞的密度抑制降低.可生长至较高的密度,总的说明：细胞生长有密度抑制血清可降低密度抑制转化细胞可降低密度抑制,培养细胞的观察检测方法,活细胞的观察检测方法 培养细胞常用的染色方法 细胞生长状况有关指标的检测方法 细胞生物活性的有关化学检测方法 电子显微镜技术,一、活细胞的观察检测方法,肉眼观察 显微镜观察,细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。细胞常规检查的方法为：,肉眼观察,一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度

40、的变化。,pH 颜色 透明度,正常 7.27.4 桃红色 清亮、透明酸性产物 变浅、变黄 污染 混浊,变黄 pH pH 变红,大多数细胞适于在pH 7.27.4条件下生长，低于pH 6.8或高于pH 7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH 降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。若培养瓶、瓶塞漏气，使CO2溢

41、出，或者由于洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，致使细胞难以生长，甚至死亡。,倒置显微镜观察,生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。,显微镜观察,细胞的生长状态,BMSCs,Anip973,细胞老化现象，表现为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去贴壁能力，从培养瓶底脱落。,相差显微镜（phase contrast

42、 microscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代 荷兰 Zernike 原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。,活细胞的观察检测方法,暗视野显微镜技术观察活细胞 缩时显微镜摄影观察 体外活细胞染色观察,暗视野显微镜技术观察活细胞（dark field microscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大

43、，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较昂贵,体外活细胞染色观察,体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。,碱性染料酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）,活体染料,噻嗪类（次甲基蓝、甲

44、苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）,中性红染色 常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。结晶紫染色 使用浓度为0.1，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。台盼蓝染色 用0.5浓度的台盼蓝（trypan blue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。,二、培养细胞常用的染色方法,细胞固定的基

45、本方法 细胞常用的染色方法 细胞特殊的染色方法,1、细胞固定的基本方法,固定组织、细胞的目的：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。固定组织、细胞的原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。,固定前的准备：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。悬浮细胞：离心（8001000r/min）PBS/Hanks漂洗23次 贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片PBS/Hanks漂洗23次注：漂洗的目的是去除血

46、清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。,常用固定液,简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL 80酒精5mL 冰乙酸5mL 40甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL 纯酒精30mL 氯仿10mL 冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。,2、细胞常用的染色方法,H.E（苏木精-伊红）染色法原理：碱性染料苏木精和酸

47、性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。染液配制：染色步骤：染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。,Giemsa（吉姆萨）染色法,母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56保温2h后，加入33mL纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。染液配制：取9份pH6.87.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合即可。染色步骤：细胞标本用甲醇/醋酸固定液固定30min

48、后，用滴管把染液布满玻片上，染色1015min，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。注意事项：染液宜现配现用，保存时间最好不用超过48h，Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要调准确。,3、细胞特殊的染色方法,Feulgen染色法 Coomassie染色法 PAS反应法 油红O（oil red O）法 免疫荧光染色法 免疫酶染色法,Feulgen（福尔根）染色法,原理：在60条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L 盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中

49、，RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA 进行特异性染色 试剂配制：1mol/L HCL：浓HCL 8.5ml 蒸馏水 91.5ml Schiff试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处 染色过程：选用Carnoy固定液 染色结果：细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。,考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法,原理：显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法试剂配制：固定液：0.1mol/L NaH2PO42H2O 14.0mL 0.1mol/L Na2HPO412H2O 36.0mL蒸馏水50.

50、9mL25戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL冰醋酸7.0mL考马斯亮蓝0.02g染色过程：染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。,过碘酸席夫反应法（periodic acid Schiff reaction，PAS）,原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。细胞内糖类的染色方法 试剂配制：染色过程：染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。,细胞内脂类的染色方法,苏丹（Sudan）/法 苏丹黑法 Lillie油红O（oil red O）法 Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法 锇酸（osmic acid）法,油红