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1、生化分离工程,第四章 细胞破碎和分离提取技术,破碎缓冲液,一般为，pH为78的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液（与细胞内环境相似）,抗氧化剂：含二硫键的蛋白质，细胞内：高度还原；外界氧化环境。eg.二硫苏糖醇DTT，2-巯基乙醇 2-BME，半胱氨酸Cys、谷胱甘肽GSH（还原型）,酶抑制剂：针对性添加，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF、巯基蛋白酶抑制剂碘乙酸、金属蛋白酶EDTA，etc,PVP：植物组织的破碎过程化中常用聚乙烯吡咯烷酮PVP吸收酚类物质（酚类物质会与蛋白质结合形成沉淀）,细胞破碎（Cell disruption）,细胞的结构动物/植物和微生物：前者没有细胞壁，只有脂质和蛋白质构成的柔软
2、的细胞膜，易于破碎细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁比阴性菌的细胞壁坚固Why？较难破碎。酵母或其他真菌：胞壁由葡聚糖、甘露聚糖等多糖和蛋白质构成，比革兰氏阳性菌的胞壁厚,G+：典型金黄色葡萄球菌，肽聚糖60-95%G-：典型E.Coli，肽聚糖10%不同类型细菌的细胞壁结构成分：,酵母菌：由甘露聚糖、蛋白质和葡聚糖组成的“三明治”结构，其中葡聚糖主要维持细胞壁强度,4.1 细胞破碎技术,细胞破碎的目的：使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物,机械法,非机械法,1、机械方法破碎,1）珠磨法（bead milling）：细胞悬浮液与极小的研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起
3、高速搅拌，细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切，使细胞达到某种程度破碎，释放内含物,可采用间歇式或连续操作珠磨机增加装珠量、延长破碎时间、提高转速等手段可提高破碎率总能耗增加且须注意换热,适用于多数微生物细胞，esp.有大量菌丝体的微生物（藻类和真菌菌丝）和质地坚硬（亚细胞器）的微生物细胞,2）高压匀浆法（high-pressure homogenization）,破碎原理：利用高压使悬浮液通过针形阀，从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击后，急剧释放到低压环境破碎作用力：突然减压和高速冲撞,阀座,阀,撞击环,操作参数少且易于确定，实验室及工业生产中均可适用于酵母和多数细胞
4、的破碎对易造成堵塞的团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬的亚细胞器一般不适用,3）超声波破碎（ultrasonication）,机理：高于20kHz的超声作用下产生的空穴化作用，空穴由于超声波的冲击而产生和闭合，产生极大的冲击波和剪切力。,缺点：A、影响因素多，细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状；B、有效能量的利用率低；C、产热大，需控温；D、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,机械破碎法总结,以上几种机械破碎法的作用机理不尽相同，有各自的适用范围（包括菌体细胞、细胞发酵液的特性）和处理规模（实验室或工业用）,2、细胞物理破碎方法,1）渗透压冲击法（osmotic shock
5、）最为温和的一类细胞破碎方法，适用于易于破碎的细胞，eg.动物细胞和革兰氏阴性菌。细胞于高渗介质中？脱水达到平衡后，迅速将其转置于低渗透压的水或缓冲液中，水进入细胞使胞壁和胞膜破裂,2）冻结融化法（Freezing and Thawing）细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次使细胞破坏，对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效,3、化学法破碎,用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择性地渗透出来化学渗透法,利用酸碱调pH；有机溶剂甲苯；表面活性剂十二烷基磺酸钠、Triton X-100；螯合
6、剂乙二胺四乙酸EDTA等,优点：细胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、价格昂贵，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比机械破碎速度低、效率差，常需与机械法连用。,4、生物法破碎,原理：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性,溶菌酶lysozyme适用于G的细胞壁，若配合EDTA、TritonX-100则可有效作用于G的胞壁；真核细胞需用不同的酶：酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破坏植物细胞壁需用纤维素酶,优点：产品释放的选择性高、产品破坏少、对温度及pH等外界条件要求低，不残留细胞碎片等，不同的细胞壁结
7、构决定了需要不同的酶,4、生物法破碎,自溶：通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂，诱使细胞产生溶解自身酶的方法,溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的适用性使该法不可能实现大规模应用，esp.G-的酶溶更受到了限制,5、超临界细胞破碎技术,超临界流体：温度和压力处于临界条件之上的流体，具有类似于气体的性质（低黏度）和类似于液体的高密度，具有较好的流动性能、传质性能和溶解性能,利用超临界CO2做介质，高压CO2易于渗透到细胞内。突然降压后，因细胞内外较大的压差使细胞急剧膨胀而发生破裂可破碎细胞壁较厚的细胞如酵母甚至对粘稠的酵母浆都有很好的破碎效果,破碎方法的选择,选择的一般原则A、
8、提取产物在细胞质内，用机械法破碎B、提取产物在细胞膜附近，用化学法C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法,破碎过程中应注意的问题A、多种破碎方法相结合可产生很大优势B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响D、菌种的培育及改造，胞内产物 胞外产物,4.2 Buffers,What is buffer？Why use buffer？,pH=pKa 0.5时，作为buffer，其缓冲能力最强,补充1,磷酸盐缓冲体系,For most biochemical purposes,pKa2 is of grea
9、test interestWhy？,How to making a buffer？,溶液：1/15 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4、pH7.5缓冲液含1 mmol/L EDTA0.15 mol/L NaCl2mol/L尿素3mmol/L GSH和0.6mmol/L GSSG 1L,方案1,磷酸盐缓冲液（1/15 mol/L，pH7.5）：600mL 1/15mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4）与400mL 1/15 mol/L磷酸二氢钠（NaH2PO4）混匀。,1L 1/15 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液、pH7.5 buffer A,另取一烧杯，分别称取1
10、mmol EDTA；0.15 mol NaCl；2mol 尿素；3mmol GSH和0.6mmol GSSG,用buffer A溶解并定容至1L,方案1,Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH8.0）：50mL 0.1 mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与29.2mL 0.1 mol/L盐酸混匀后，用去离子水定容至100mL。,“x”ml solution of A“y”ml solution of B,The presence of extra salts may change the pH or molarity of the buffer due to common
11、ion effects,方案2,Choose the buffer（with a pKa as close as possible to the desired pH）Indentify whether the buffer is made from an acid or a base（buffer由哪种酸或碱构成？）Choose the species that gives no-products when titrated（选择一种，使得其用HCl或NaOH滴定时无副产物出现）,Calculate the mass required to give the required molarit
12、y计算并称量配制溶液所需的质量Add all components,titrate to the pH and make up the volume（加入所有其它组分，用HCl或NaOH 调至所需pH并定容）pH计工作原理及使用注意事项,描述缓冲液的两个指标：缓冲液的摩尔浓度 缓冲液pH,小结,缓冲液的pKa值尽可能接近预期pH（pH0.5）温度改变、溶液稀释及添加中性盐的情况下，缓冲液pH变化尽可能小缓冲物质不与实验中其他物质发生反应，不干扰实验的检测（eg.硼酸盐/糖蛋白，280nm处有光吸收）,一般常用的缓冲液都有现成的配方，可查阅相关参考书利用特定的缓冲液计算软件或者网上缓冲液计算软件
13、：http:/,4.3 Assays for activity and concentration,Most proteins have some form of unique functional activity（具有一种活性）,which defines the specific protein.Before the protein can be isolated,it is necessary to conceive of(确定)an activity and to devise（设计）an appropriate assay.,补充2,The activity assay shoul
14、d be:specific,to define the protein of interest and distinguish it from all othersquantitative,so that the success of the purification can be monitored economical in terms of time and material.,干扰素含量测定（MTT法生物学活性测定）,原理：干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2等)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度
15、的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。材料：VSV、Wish细胞、MTT、二甲亚砜(DMSO)、10FCSRPMI1640、培养板、培养瓶、CO2孵箱、超净台、酶标检测仪。活性定义：以保护半数(50)Wish细胞免受病毒VSV损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。,尿激酶活性测定,尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤蛋白溶酶原是唯一的天然蛋白底物，在生物体内，它作用于精氨酸-缬氨酸键，使纤溶酶原转化为有活性的纤溶酶。对合成底物的活性与胰蛋白酶和纤溶酶近似，也具有酯酶的活力，可作用于N-乙酰甘氨酰-L-赖氨酸甲酯。对血纤维蛋白、血纤维蛋白原等都有溶解作用，从而达到溶血栓、抗凝血作用，所以
16、是一种十分有效的溶血剂。在临床上，尿激酶已广泛应用于治疗各种新血栓的形成或血栓梗塞性疾病。,尿激酶活性测定,取琼脂糖10mL，纤维蛋白原溶液5.0mL，在40-60oC迅速加入（牛纤维蛋白溶酶原溶液0.2ml）、凝血酶溶液0.5mL，立即混匀，倒入平皿（直径9cm），制成厚度约0.2cm的纤维膜。分别加入不同浓度的标准液及供试品液各10mL于膜上，盖上盖，于37oC培养箱保温18h后取出，分别量出每个溶圈垂直的两直径。以溶圈直径（平均）为纵坐标，标准品效价为横坐标，做标准曲线,胰蛋白酶 活性测定,胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具
17、有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键 酰胺键 肽键。可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。,Concentration assays,A number of methods are available for m
18、easuring protein concentration Each being based on a specific property of proteins Each having certain advantages and disadvantages.,1、Absorption of ultraviolet light,The extinction coefficients(消光系数)of proteins differ,UV-absorption is useful as a qualitative（定性）measure,for detecting the presence of
19、 protein（检测蛋白质是否存在）But is less useful for accurate quantitative measurements（准确定量测定）Except for pure proteins of known extinction coefficient.,Because of its simplicity,UV absorption is the method favored for continuous(semi-quantitative)monitoring of the protein concentration in the eluate from chro
20、matography columns.,One of the limitations of UV-absorbanceUV-absorbing,non-protein,compounds（具有紫外吸收的非蛋白质物质）may interfere with（干扰）the measurement.,An elegant method for eliminating the absorption due to nucleic acids,thus allowing a measurement of protein must be taken,Nucleic acids,which are ubiqui
21、tously（无所不在的）present in biological material,absorb UV radiation strongly,with a profile overlapping that of protein,but with a maximum at 260 nm.,2、The biuret assay,In alkaline solution,proteins（with peptide bonds）reduce Cu2+to Cu+to give a blue coloured complex.Because the reaction is with peptide
22、bonds,there is little variation in the colour intensity given by different proteins（不同蛋白质的光吸收强度差别不大）.The biuret method can be used for the measurement of protein concentration,A disadvantage of the biuret method：It is relatively insensitive(灵敏度低),so that large amounts of protein are required for the
23、 assay（每次蛋白质含量测定时所需蛋白质量要很大）.Another limitation is that amino buffers,such as Tris,which are commonly used in the pH range 8-10,can interfere with the reaction.,3、The Lowry assay,May be considered as an extension of the biuret assay.Initially,a Cu+-protein complex is formed,as in the biuret assay.Cu+
24、（or protein 中Phe、Tyr）then reduce the so-called Folin-Ciocalteureagent(福林-酚试剂),to yield an intense blue colour.,An advantage of the Lowry over the biuret assay：much more sensitive,and thus consumes much less of the protein sample.Disadvantage：more sensitive to interference对很多干扰试剂敏感,a consequence of t
25、he more complicated chemistry involved需要配置很多种复杂试剂.,4、The bicinchoninic acid(BCA)assay,Bicinchoninic acid（二喹啉甲酸）forms a 2:1 complex with Cu+formed in the biuret reaction resulting in a stable,highly coloured chromophore（高吸收特性的生色团）with an absorbance maximum at 562 nm.,The BCA assay is more sensitive t
26、han the Lowry method and is also less subject to interference by a number of commonly encountered substances.Sensitive to interference by strong reducing agents（强还原剂Why？）,e.g.ascorbic acid（抗坏血酸）.,5、The Bradford assaythe dye-binding method,Coomassie blue G-250,dissolved in acid solution（酸性溶液中）,below
27、pH 1,is a red-brown colour（红褐色）regains its characteristic blue colour when it becomes bound to a protein（与蛋白质形成复合物后）.The concentration of protein can therefore be measured by the extent to which the blue colour,measured at 595 nm,is restored.,Advantages:Simplicity,sensitivity and resistance to inter
28、ference.,5）The Bradford assaythe dye-binding method,G-250 binds largely to basic and aromatic amino acids.Different proteins will differ in their content of these amino acids and so,ideally,a standard curve should be elaborated for each specific protein.,Disadvantage：the reagent tends to stick to gl
29、ass and plasticware塑料器材.For this reason,the use of disposable cuvettes一次性试管 is recommended.Or the dye can be removed from surfaces by using SDS.,蛋白质分析作业,若想分析破胞后所得粗酶液（或发酵液离心后上清液）的蛋白质含量，可采用哪些分析方法？,实验室在分离纯化基因重组E.coli所表达的-干扰素含量时，当分离的初级阶段，测定蛋白质浓度时建议采用哪种？当进行多步色谱法纯化之后，电泳检验为单一条带，此时建议采用哪种蛋白质分析方法来确定含量？,蛋白质含量的诸多分析方法中，哪种适用于混合蛋白质含量的测定？各有何优缺点？哪种适用于纯度较高的蛋白质含量测定？各有何优缺点？,
