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1、第二节 定量分析样品的前处理方法 一、概述 1.结构特征与分析方法之间的关系 含卤素有机药物 R-X（F，Cl,Br,I）卤素与芳环相连 Ar-X 结合牢固，需有机破坏 卤素与脂肪链相连 R-X 结合较不牢固，不需有机破坏 含金属有机药物 含金属有机药物 R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物；结合不牢固，可直接测定 有机金属药物 R-Me，结合牢固，适当处理后测定,三氯叔丁醇,泛影酸,碘番酸,酒石酸锑钾,富马酸亚铁,含金属有机药物,卡巴胂,不经有机破坏的分析方法2.药物分析中常用的分析方法 经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法 例如：富马酸亚铁的含量测定,终
2、点：邻二氮菲(+Fe3+),溶于热稀硫酸,Fe2+,铈量法,Ce4+,Fe3+,指示剂:邻二氮菲,(+Fe2+),红色,淡蓝色,（二）经水解后测定法 碱水解后测定法 适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃 例如：三氯叔丁醇的含量测定 CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2O NaCl+AgNO3 AgCl+NaNO3,（三）经还原分解后测定法 适用于Ar-I的药物 例如：泛影酸的含量测定,指示剂：曙红钠终点：黄红,三、经有机破坏的分析方法 金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏 湿法破坏 药物分析中常用的有机破坏的方法有 H2SO4-HNO3
3、法(一)湿法破坏 H2SO4-HClO4法 H2SO4-硫酸盐法 H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等,干法破坏,低价态金属离子,（二）干法破坏 适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物中Se盐的检查 1.高温炽灼法 加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或ZnO以助灰化,2.氧瓶燃烧法,空心,A.燃烧瓶 B.铂丝网 C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法 E.F.G.称取固体样品方法,A,G,F,E,D,C,B,氧瓶燃烧装置及称样方法,1）仪器装置 500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质 玻璃锥形瓶 2）称样 固体样；液体样要求 3）燃烧分解操作法 4）吸收液
4、的选择 用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为 H2O-NaOH-H2O2.,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOH 溶液 2ml与H2O 10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10 ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min，以除去剩余的溴蒸气，加KI 2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。,应用示例：碘苯酯的测定,碘苯酯的测定-反应方程式,第三节 药品分析方法验证 目的：证明采
5、用的方法适合于相应检测要求。起草药品质量标准 生产工艺变更 制剂组分改变 原分析方法修订,均需对分析方法进行验证,验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性,一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度 1.原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较,2.制剂：考察其他组分和辅料对回收率的影响用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药向制剂中加入已知量的被测物进行测定,与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较（二）具体做法：测定高、中、低三个浓
6、度，n=3,共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%102%；容量法可达99.7%100.3%。,二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样 品，经多次测定所得结果之间的接近程度。（一）精密度表示方法 1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X 相对偏差（RD）d/X 100,最大相对偏差（允许差）容量分析法0.3，仪器分析法3,2.标准偏差（standard deviation,SD或S）S=(Xi X)2/(n-1)1/2 3.相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)RSD=标准偏差/平均值100%=
7、S/X 100%,（二）验证内容,1.重复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.2.中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析 人员用不同设备测定结果的精密度。,重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精 密度。（三）数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限,三、专属性 指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性 鉴别、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应,（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性
8、。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,Chromatogram of BCEOC-labeled neurotransmitters standard(100 pmol in 10 L),四、检测限（LOD)是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色
9、鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。,五、定量限（LOQ)是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。,LOQ,S/N=,Neurotransmitters standard at 2.441 nM,六、线性 是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好,可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应
10、值对浓度作图，建立回归方程，求出r 如UV：制备一个标准系列，浓度点n=5 建立回归方程C=aA+b r 0.9999,七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。,如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度的80%120%。制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的70%130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的20%。,八、耐用性 是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温
11、度等。,分析方法效能指标的具体应用：1.用于鉴别试验：只要求专属性、耐用性2.用于原料药中杂质测定和制剂中降解产物测定的方法：用于定量：除检测限不要求外，其余指标均要求。限度检查：只要求检测限、专属性、耐用性3.原料、制剂的含量测定及溶出度测定：不要求检测限和 定量限，其余均要求。,第四节 生物样品分析方法的基本要求 一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术,一、常用样品的种类、采集和贮藏,（一）血液测定药物浓度指测定血浆或血清中的药物浓度采集制备血浆或血清贮藏：短期4、长期-20（二）唾液采集：自然分泌贮藏：4以下,（三）尿液 用于药物剂量回收研究，尿清除率、生物利用度等的
12、研究采集：自然排尿，时间尿，一定时间内排泄的尿液全部储存起来，记录体积,二、生物样品分析前处理技术,为什么要对生物样品进行前处理？蛋白质的去除方法？常用的分离、纯化方法？被测组分的浓集方法？,为什么要进行前处理？,存在形式多样：游离型药物、与蛋白质结合型药物、代谢物、葡萄糖醛酸苷、硫酸酯缀合物等成分复杂：蛋白质、糖、脂肪、尿素 Na+、K+、X-等,（一）去除蛋白质 释放结合型药物、减少提取过程中乳化、保护仪器、提高灵敏度加入与水混溶的有机溶剂中性盐(常用硫酸铵、硫酸钠)强酸（三氯醋酸、高氯酸、苦味酸）加入含锌盐、铜盐的沉淀剂酶解法（二）缀合物的水解酸水解/酶水解,（三）有机破坏 测定生物样品
13、中的金属离子，常用HNO3-HClO4作为消解剂，一般得到高价态金属离子（四）分离、纯化和浓集 使被测物在所用分析技术的检测范围内，常用萃取法,有机相水相,药物,杂质,2（1）：1,多在酸碱性条件下萃取,液-液萃取法（LLE）,（乙醚、氯仿）,有机相水相,2（1）：1,药物,杂质,多在酸碱性条件下萃取,液-固萃取法（LSE）相当于缩小的柱色谱法浓集 末次萃取液尽量少 挥去萃取溶剂,（五）化学衍生化（略）可使药物：具有能被分离的性质 提高灵敏度 增强稳定性 提高对光学异构体分离的能力,练习与思考,A型题,1相对标准偏差表示的应是A准确度 B回收率 C精密度 D纯净度 E限度,2表示两变量指标A与
14、C之间线性相关程度常用A相关规律 B比例常数 C相关常数 D相关系数 E精密度,14A空白试验 B对照试验 C回收试验 D鉴别试验 E检测试验1以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验2在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验3用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验4取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色,A,C,D,B,B型题,X型题,1药物分析方法的效能指标有 A检测限 B耐用性 C准确度 D专属性 E代表性2对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有 A耐用性 B专属性 C检测限 D准确度 E线性与范围,3用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为 A11 B21 C31 D41 E51,
