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1、新药研究中的动物实验方法,2023/8/24,2,新药研究,从发现到批准投产上市，从药学、药理学、毒理学和临床医学等各方面的系统研究过程安全性、有效性评价药物临床前研究应当执行有关管理规定，其中安全性评价研究必须执行国家非临床研究质量管理规范（GLP）认证从事药物临床试验的医疗机构须通过国家药物临床试验机构资格认证，必须执行药物临床试验质量管理规范（GCP）,2023/8/24,3,新药研究,主要药效学试验中的动物实验方法急性毒性试验中的动物实验方法长期毒性试验中的动物实验方法安全药理学试验中的动物实验方法生殖毒性试验中的动物实验方法致突变试验中的动物实验方法致癌试验中的动物实验方法刺激性、过
2、敏性和溶血性试验中的动物实验方法依赖性试验中的动物实验方法,2023/8/24,4,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法新药的主要药效学作用：应用体内外2种以上实验方法获得证明，其中一种须是整体的正常动物或模型动物实验模型：必须能反映药理作用本质指标：应能反映主要药效学作用的药理本质，客观可靠，能定量或半定量主要药效学指标：心肌梗死面积次要药效学指标：血清酶学指标说明新药作用特点的指标：凝血、血小板功能提示药物作用机制的指标,2023/8/24,5,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法剂量：应作出量效关系，尽量求出ED50或有效剂量范围给药方
3、法：采用拟推荐临床用的给药方法，预防性给药/治疗性给药对照：空白对照组：正常动物对照观察，与给药组进行相同处理，检测试验方法可靠性，防止假阳性；评价造模是否成功。模型对照组阳性药物对照组药物至少3个剂量组，高中低剂量差为2-3的等比级数。,2023/8/24,6,第一节 主要药效学试验中的动物实验方法,一、主要药效学研究方法阳性对照药物选择：已批准上市、公认最有效及作用机制相同或相似的药品。同一受试药物在几个药效学实验模型中可采用不同的阳性对照药物比较新药的作用特点，作用强度、起效快慢阳性药必须出阳性结果：验证所用方法和指标的可靠性、准确性、防止假阴性,2023/8/24,7,二、动物选择及模
4、型建立,（一）动物选择健康、符合实验动物管理要求的动物；根据实验要求选择不同等级的实验动物动物的年龄多采用成年动物研究药物对生长、发育、内分泌系统作用：幼年动物抗衰老：老年动物或衰老过程较快的专用模型动物动物性别雌雄各半致畸实验或雌性生殖系统药物、热板法实验：雌性动物男性抗生育药：雄性动物,2023/8/24,8,二、动物选择及模型建立,（一）动物选择注意种属异同性尽可能选用与人在生物学上接近，在解剖、生理功能相类似的动物，应选用靶器官高效应实验动物每组大鼠、豚鼠、家兔等动物一般不得少于8只；犬和猴等大动物可设2个剂量组，每组不得少于6只；以避免个体差异和实验误差，以便进行统计学处理,2023
5、/8/24,9,药效学试验中的动物选择,2023/8/24,10,二、动物选择及模型建立,（二）模型建立动物模型的治疗效果与人体使用结果基本相同：抗感染动物模型、小鼠镇痛模型、豚鼠过敏性哮喘模型无合适的模型：银屑病、秃发、红斑狼疮、视网膜炎等，可采用间接指标，如改善皮肤微循环、测量毛发生长速度、数量与弹性，测定皮肤胶原蛋白含量及观察眼结膜的微循环等不大好建立的模型：癫痫、慢性萎缩性胃炎等。需要多种方法验证某些疾病模型至今无法建立：神经官能症、精神病、眩晕症、四肢麻木、幻觉等,2023/8/24,11,二、动物选择及模型建立,（二）模型建立药效学实验，至少有一种整体模型；采用多种方法制备动物模型
6、，以评价药物疗效老年痴呆动物模型：胆碱能损伤模型；b淀粉样蛋白致痴呆模型注意模型损伤程度，严重损伤模型难以显示药物疗效特异性好、能反映药理作用本质的离体实验模型亦可蛙坐骨神经腓肠肌标本：肌松药研究果蝇：抗衰老药物注意整体动物模型与体外模型的药理反应之间的差别,2023/8/24,12,第二节 药物临床前安全性评价的意义和局限性,一、临床前安全性评价的意义：提供新药对人类健康危害程度的科学依据，预测上市新药对人体健康的有害程度通过药物毒理学的研究方法和手段来进行观察和测定化学物质对机体引起的损害，发病机制以及对机体全身的影响,2023/8/24,13,二、动物毒性试验评价的局限性,实验动物和人对
7、药物反应种属性差异：动物和人共同反应约占一个药总反应的25%。实验动物的数量有限：发生率低的毒性反应，在少量的动物中的难以发现实验动物的反应单一；临床病人广泛，对药物的敏感性各不相同实验动物与人的生理状态差异：某些疾病的存在是发生某些毒性反应的重要前提试验剂量与临床剂量的差异,2023/8/24,14,三、安全性评价的基本要求,找出毒性剂量：LD50；长期给药产生毒性的剂量确保安全剂量范围：单次或多次给药的有效范围发现毒性反应毒性靶器官的寻找毒性的可逆与否：不可逆损伤，一般不批准上临床解救措施,2023/8/24,15,第三节 急性毒性试验中的动物实验方法,急性毒性试验（单次给药毒性试验）研究
8、动物一次或24h内多次给予受试物后，一定时间内所产生的毒性反应药物毒理研究的早期阶段,2023/8/24,16,急性毒性试验 作用,阐明药物的毒性作用及其毒性靶器官为长期毒性试验剂量和药物期临床实验起始剂量的提供剂量依据提供一些人类药物过量急性中毒相关的信息,2023/8/24,17,一、主要内容和要求,受试物：制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品；标明名称、来源、批号、含量、保存条件、配制方法等，自检报告。所用辅料、溶媒动物：至少采用2种哺乳动物，啮齿类：大鼠、小鼠非啮齿类：犬（Beagle犬、杂种犬）、猴根据实验特点，确定动物性别、年龄初始体重差异在平均体重20%以内，小鼠（18
9、-22g），犬（9-11kg），猴（3-6kg）实验动物质量合格证,2023/8/24,18,一、主要内容和要求,剂量和分组：应从未见毒性剂量到出现严重毒性（危及生命）的剂量设空白和/或溶媒对照组小动物4-6个剂量组，组距；大动物一般6只犬，采用50%等量递升法，求出ALD（近似致死剂量）和MTD（最大耐受量）给药容积：等容积不等浓度给药，给药途径：临床拟用途径和一般能使原形药物较完全进入循环的途径；经口给药前动物一般应进行一段时间的禁食不禁水,2023/8/24,19,一、主要内容和要求,观察时间及指标：给药后，一般连续观察至少14天，给药当天，尤其是4h内严密观察。后每天上下午各一次毒性反
10、应出现时间及其恢复时间一般指标：动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等死亡情况（死亡时间、濒死前反应）体重变化病理学检查：大体解剖：体积、颜色、质地组织病理学检查,2023/8/24,20,二、急性毒性实验常用方法,（一）近似致死剂量法非啮齿类动物的急性毒性试验6只健康比格犬（4-6月龄）或猴（2-3岁）估计可能引起毒性和死亡的剂量范围按50%递增法，一般设计出含10个左右剂量的剂量序列表；根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围,2023/8/24,21,（一）近似致死剂量法,2023/8/24,22,（二）最大给药量法,适用于低毒的受试物在药剂上允许的最大给药浓度及生理上允许
11、的最大给药剂量的条件下，以允许的最大剂量单次给药或24h内多次给药（剂量5g/kg体重），观察动物出现的反应。10-20只动物，连续观察14天,2023/8/24,23,（三）固定剂量法,不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价预试：4个固定剂量（mg/kg）：5、50、500、2000（5000）实验动物：大鼠 单次给药从4个剂量中选择一个作为初始剂量（500mg/kg），如无毒性反应，可用2000mg/kg进行预试此剂量如无死亡发生即可结束预试如出现严重毒性反应，降低一个档次剂量进行预试。如该动物存活，在此2个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量一只动物，不超过5只
12、。每个剂量试验之间间隔24h。观察期7天,2023/8/24,24,（三）固定剂量法,正式试验：每个剂量至少10只动物，雌雄各半根据预试结果，在4个剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量，如预试结果表明，5mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行观察时间 2周，根据毒性反应具体特点可适当延长,2023/8/24,25,（三）固定剂量法试验结果评价,2023/8/24,26,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,特点：节省动物；同时进行毒性症状的观察、估算LD50及其可信限，适合能引起动物快速死亡的药物限度试验：用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况主试验：用于相关毒性资料很少或没有时，
13、或预期受试物有毒性时,2023/8/24,27,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,限度试验：最多用5只动物进行的一个序列试验2000mg/kg剂量水平的限度试验,存活,2023/8/24,28,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,限度试验：5000mg/kg剂量水平的限度试验3只死亡，LD503只存活，LD505000mg/kg,死亡,2023/8/24,29,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,主试验：特定给药程序每次给药1只动物，间隔约48h（取决于毒性出现时间，持续时间和毒性的严重程度）第一只动物剂量低于LD50的最接近的估计值该动物存活，第2只给予高一级剂量该动物死亡或出现濒死状态，给予低一级剂
14、量剂量级数因子：（1/剂量反应曲线斜率估计值）的反对数无受试物斜率相关资料时，使用3.2为剂量级数因子；1.75mg/kg、5.5、17.5、55、175、550、2000（或5000）无受试物致死估计值时，从175开始,2023/8/24,30,（四）上下法（阶梯法、序贯法）,主试验决定是否和如何对下一只动物给药前，每只动物均应认真观察达48h当满足停止试验标准之一后，停止给药，根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区停止试验条件：连续3只动物存活任意连续6只动物中有5只连续发生存活或死亡转换第1只动物发生转换之后至少有4只动物进行实验，并且通过计算LD50估算值的范围超出临界值（
15、2.5倍）,2023/8/24,31,（五）累积剂量设计法（金字塔法）,非啮齿类动物急性毒性实验8只动物，对照组+给药组，雌雄各半剂量设计（mg/kg）1、3、10、30、100、300、1000、300010、20、40、80、160、320、640、1280隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐增加，直至出现动物死亡或达到剂量上限位置,2023/8/24,32,（五）累积剂量设计法（金字塔法）,无动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或限制剂量以最高剂量给予动物5-7d某一剂量所有动物死亡，MLD和LD50应在最后两个剂量之间某一剂量部分动物死亡，并有部分死亡出现在后继的下一个高
16、剂量，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一个低剂量之间，LD50应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间,2023/8/24,33,（六）半数致死量法,预备实验：先找出100%及0%死亡的剂量，即Dm，Dn取小鼠9-12只，每组3只，按估计量给药3只小鼠全死，降低剂量全不死，增加剂量确定组数n，计算各组剂量（按等比级数排列）,dn=d(n-1)r,2023/8/24,34,（六）半数致死量法,正式实验：分组：每组10只，雌雄各半，随机分配给药：每只动物给药容量相同观察记录：给药后中毒表现，记录各组小鼠死亡数，死亡率。计算LD50及LD50 95%可信限,2023/8/24,35,第四
17、节 长期毒性试验中的动物实验方法,长期毒性试验（重复给药毒性试验）反复多次给予动物药物，观察药物对动物的毒性反应，一般指连续给药14d以上。目的、意义预测受试物可能引起的临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、剂量-反应关系和时间-反应关系、可逆性等判断受试物反复给药的毒性靶器官或靶组织推测临床试验的起始剂量和重复用药的安全剂量范围提示临床试验中需重点监测的指标为临床试验中的解毒或解救措施提供参考,2023/8/24,36,长期毒性试验,受试药物：同急毒动物：2种动物，啮齿类：大鼠（wistar和SD），以6周龄为宜，不宜超过8周龄，试验周期3个月以上可选5-6周龄大鼠，体重80-120g非啮
18、齿类：Beagle犬（6-10月龄，体重6-8kg）、猴（生物技术药物）（3-4岁，3-6kg）、小型猪（皮肤科用药）尽量选用年幼动物（敏感；观察对生长发育的影响）,2023/8/24,37,长期毒性试验,给药途径：与临床用药途径一致。口服：灌胃；混入饲料或饮水静脉注射（大鼠2个月以上）可用腹腔注射代替临床上部分给药途径在动物上很难或根本无法做到，允许用相关的替代给药途径，结合药动学比较资料。舌下给药雾化吸入肠溶衣胶囊.,2023/8/24,38,长期毒性试验,分组：低剂量组：寻找动物安全剂量范围，为临床剂量设计作参考，一般应高于整体同种动物有效剂量，此剂量下应不出现毒性反应中剂量组：应使动物
19、产生轻微的或中度的毒性反应高剂量组：寻找毒性靶器官、毒性症状及抢救措施提供依据；应使动物产生明显或严重的毒性反应，或个别动物死亡空白对照组：溶剂或其他赋形剂；有毒性时应增加正常对照组大鼠雌雄各10-30只；犬、猴雌雄各3-6只,2023/8/24,39,长期毒性试验,剂量设计方法：根据急性毒性LD50：大鼠高中低三个剂量分别用1/10、1/50、1/100 LD50。犬用更小的剂量，多为大鼠的一半剂量根据最大耐受量（MTD）：大鼠：高、中、低 1、1/3、1/10MTD犬、猴：大鼠剂量的一半，或测定犬单次口服后MTD，再设计剂量,2023/8/24,40,长期毒性试验,剂量设计方法：拟用临床剂
20、量调整根据同类型药物或国外资料的药物临床剂量，结合急毒，预测新药可能用的临床剂量,2023/8/24,41,长期毒性试验,剂量设计方法：用等效剂量推算：从一种已知动物的有效剂量或毒性剂量或可能用于人的剂量反推到实验动物的剂量,2023/8/24,42,长期毒性试验,给药周期：参考拟定临床疗程原则上应每天给药，给药期限长（3m）的药物每周至少给药6天,2023/8/24,43,长期毒性试验,检查指标一般观察：外观体征、行为活动血液学指标：红细胞计数、血红蛋白、红细胞容积、白细胞计数及分类、血小板计数、凝血酶原时间等血液生化指标：转氨酶（AST、ALT）、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶、尿素氮、肌酐、总
21、蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、谷氨酰转移酶、K+、Na+、Cl-尿液检查：pH、尿糖、蛋白、胆红素、酮体、红细胞、白细胞心电导联：大动物长期毒性,2023/8/24,44,长期毒性试验,检查指标：参考化学结构、急毒、药效学、文献病检器官系统尸检脏器系数：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、脑组织学检查：心、肝、脾、气管、主动脉、肺、肾、脑（大脑、小脑、脑干）、肾上腺、胰腺、食管、胃、十二指肠、回肠、结肠、胆囊、垂体、前列腺、脊髓、淋巴结、膀胱、甲状腺、甲状旁腺、唾液腺、乳腺、胸腺、睾丸、附睾、子宫、卵巢、眼和视神经、坐骨神经、给药局部。重要脏器、靶器官
22、、给药局部及有病理损伤的病理照片,2023/8/24,45,长期毒性试验,检查指标时间大鼠3个月以内，一般在最后1次给药后24h和恢复期结束后各进行1次。必要时中间可进行1次大鼠3个月以上，可在试验中间杀少量动物（高剂量组和对照组）检测指标犬的长毒应有正常值2次，给药后1-1.5月测1次，停药1次，恢复期结束1次。,2023/8/24,46,长期毒性试验,恢复期观察最后1次给受试物猴24h，每组杀1/2-2/3动物检测各项指标其余1/3-1/2动物继续观察2-4周，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性反应。此期间，不给受试物。观察内容与给药期间相同,2023/8/24,47,第五节
23、安全药理学试验中的动物实验方法,安全药理学（一般药理学）研究药物在治疗范围内或治疗范围以上的剂量时，潜在的、不期望出现对生理功能的不良影响，主要观察药物对中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统的影响。根据受试药物药理作用特点，在泌尿系统、自主神经系统、消化系统等方面进行追加和/或补充试验,2023/8/24,48,安全药理学,目的确定药物可能关系到人群用药安全性的非期望性药理作用评价药物在毒理学和/或临床研究中所观察到的药物不良反应和/或病理生理作用研究所观察到和/或推测的药物不良反应机制,2023/8/24,49,可免做安全药理学研究的药物,在全身体内血药浓度低，或其它组织器官分布很少的局部用药
24、，如皮肤、眼科用药等。只用于治疗晚期癌症病人的细胞毒类药物，在首次用于临床前可不做一般药理学研究。但具有新的作用机制的此类药物例外。,2023/8/24,50,一、动物实验方法,受试物：同药效学、毒理学研究实验动物：小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、犬。小动物每组不少于10只，大动物每组不少于6只。尽量采用清醒动物。如采用麻醉动物，应注意麻醉药物的选择和麻醉深度的控制。实验分组：小鼠：空白对照组、受试药低中高3个剂量组，溶剂对照组，每组10-20只大鼠：每组10只犬、猴：每组4-6只,2023/8/24,51,一、动物实验方法,给药剂量：应包括或超过主要药效学的有效剂量或治疗范围。主要药效学实验研究的最
25、大有效剂量的1、2、4倍如缺乏不良反应的结果，最高剂量应设定为相似给药途径和给药时间的其他毒理试验中产生中等强度不良反应的剂量。给药途径：采用单次给药，与临床拟用途径一致。,2023/8/24,52,二、核心组合试验,（一）中枢神经系统研究：定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉/运动反射和体温的变化，以确定药物对中枢神经系统的影响间歇观察法（去甲麻黄碱）自主活动实验洞板实验转轮疲劳实验或抓力实验对戊巴比妥钠阈下睡眠剂量的影响体温测定,2023/8/24,53,二、核心组合试验,（二）心血管系统研究：测量并记录给药前后血压（收缩压、舒张压和平均压）、ECG（QT间期、PR
26、间期、ST段、QRS波等）、HR麻醉动物测量法：beagle犬 戊巴比妥钠麻醉、动脉插管（BP）、针形电极心电、温度探头、静脉输液清醒动物测量法：植入式生理信号遥测系统，植入体（包括微型压力传感器、放大器、无线信号发射器）的发射器植入腹主动脉内，测定BP、心脑电、呼吸、体温、生理活动易于引起人类QT间期延长类的化合物，例如：抗精神病类药物、抗组织胺类药物、抗心律失常类药物和氟喹诺酮类药物，应观察药物对QT间期的影响。,2023/8/24,54,二、核心组合试验,（三）呼吸系统研究：测定并记录给药前后动物的呼吸频率和呼吸深度的变化Beagle犬 戊巴比妥钠麻醉、胸部安置呼吸流量传感器，记录呼吸频
27、率、呼吸深度变化气管或口腔内插入呼吸气流换能器，测量呼吸频率、深度、流量的变化,2023/8/24,55,三、追加和/或补充的安全药理试验,当核心组合试验、临床试验、流行病学、体内外试验以及文献报道提示药物存在潜在的与人体安全性有关的不良反应时，应进行此项试验追加的安全性试验中枢神经系统：上述CNS实验中发现药物具有中枢抑制作用行为活动：行为绝望实验、强迫游泳实验、抗攻击行为实验、高架十字迷宫实验学习记忆：跳台、避暗实验、明暗穿箱实验、迷津实验神经生化（ACh、DA、腺苷酸环化酶）、视觉、听觉,2023/8/24,56,三、追加和/或补充的安全药理试验,追加的安全性试验心血管系统：上述实验发现药物对BP和HR有影响追加药物对动物心输出量、心肌收缩力、血管阻力等心功能的影响，并探讨其作用机制呼吸系统：上述实验发现药物对呼吸频率和呼吸深度有影响追加药物对动物气道阻力、肺呼吸流量、肺动脉压力、血气分析的影响,2023/8/24,57,三、追加和/或补充的安全药理试验,补充的安全性试验泌尿系统：肾功能（尿量、密度、渗透压、pH值、电解质平衡、蛋白质、尿糖、细胞和血生化（BUN、肌酐、蛋白质）自主神经系统：对自主神经系统有关受体的影响，直接刺激作用、压力反射和心率消化系统：胃液分泌量、pH值、胃肠损伤、胆汁分泌、体内药物转运时间等指标,谢 谢,
