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1、蛋白酶活性的测定方法及原理,罗老师,组员,宁舒婷,陈丽君,陈海梅,王熙栋,各种测定方法及原理,考马斯亮蓝法,甲醛滴定法,DHT-酪蛋白法,DNA-溴乙锭荧光分析法,X-光胶片法,福林酚法,3,甲醛滴定法,考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。,考马斯亮蓝法,4,蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。,
2、考马斯亮蓝法,甲醛滴定法,5,用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。,考马斯亮蓝法,DHT-酪蛋白法,6,溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭(0.5g/mL)与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴
3、乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。,考马斯亮蓝法,DNA-溴乙锭荧光分析法,7,酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。,考马斯亮蓝法,X-光胶片法,8,福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪
4、氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。,考马斯亮蓝法,福林酚法,福林酚法测定蛋白酶活性,蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。,分析天平：精度0.0001g恒温水浴：精度0.2计时表分光光度计沸水浴器振荡混合器 pH计:精度0.01pH单位乳酸缓冲液（pH
5、=3.0）适用于酸性蛋白酶磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶硼酸缓冲液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶0.4mol/L碳酸钠溶液0.4mol/L的三氯醋酸液0.5mol/L的NaOH10.00mg/ml酪素溶液100g/ml酪氨酸标准溶液,标准曲线的绘制,L-酪氨酸标准溶液按下表配制,分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准
6、曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数K值，其K值应在95100范围内。,实验步骤,蛋白酶活性的计算,K：吸光常数,Title,1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40（酸性pH=3.0、中性pH=7.5、碱性pH=10.5）条件下，1min水解酪素产生1g酪氨酸为一个酶活力单位。,蛋白酶的活力=AK4/10n U/g(ml),A：样品平行试验的平均OD值,K：吸光常数,4：反应试剂的总体积0：酶解反应时间 n：酶液稀释总倍数,1,思考题,Title,蛋白酶有哪几类？按蛋白酶水解蛋白质的方式：A内肽酶：切开蛋白质分子内部肽键，生成相对分子质量较小的多肽类；B外肽酶
7、：切开蛋白质或多肽分子氨基或羧基末端的肽键，而游离出氨基酸的酶类；C水解蛋白质或多肽的酯键；D水解蛋白质或多肽的酰胺键。按酶的来源可分为：动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶 微生物蛋白酶又可分为：细菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放线菌蛋白酶 按蛋白酶作用的最适PH可以分为（A）PH2.55.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.510.5的碱性蛋白酶，（C）PH78的中性蛋白酶,影响酶活力的因素有哪些？酶浓度对酶活力的影响：酶促反应速率与酶分子的浓度呈正比，在一定范围内，当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。底物浓度对酶活力的影响：若酶的浓度为定值，底物的起始浓度越低时，酶促反应
8、速度与底物浓度呈正比，即随底物浓度的增加而增加。当 所有的酶与底物结合生成中间产物后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度也不会增加，酶促反应速度也不会增加。温度对酶活力的影响：在适宜的温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增加，超过最适反应温度，酶活力将会下降。PH对酶活力的影响：酶在最适PH范围内表现出活性，大于或小于最适PH，都会降低酶活性。激活剂对酶活力的影响：某些无机阳离子、阴离子、有机化合物可作为激活剂，能够激活酶，使其表现出催化活性或强化其催化活性。抑制剂对酶活力的影响：酶的抑制剂能够减弱、抑制甚至破坏酶的活力，它可降低酶促反应速度。,使用紫外分光光度计时应注意哪些问题？使用的比色皿必须洁净，并注意配对使用。手指应拿毛玻璃面的两侧，装盛样品量以2/3为度。透光面要用擦镜纸擦拭干净。比色皿使用前应用试样润洗，使用后应立即用自来水冲洗干净，倒置晾干。测定溶液的吸光度值应在0.10.7间最符合吸收定律，线性好，读数误差小。吸光值在测定前应用空白溶液校正调零，再进行测定。,K：吸光常数,Title,
