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1、实验二、蛋白质的颜色反应及含量测定,一、实验目的,1.1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。1.2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。1.3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。1.4、学习考马斯亮蓝法、双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法,二、实验重点难点,2.1、双缩脲反应及茚三酮反应的实验原理2.2、对于双缩脲反应中碱和硫酸铜的添加顺序2.3、茚三酮反应中颜色变化过程2.4、测定蛋白质含量的实验原理、标准曲线制定,三、实验原理,3.1、概括蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子。氨基酸的基本结构为：蛋
2、白质的主要连接方式为：,3.2 蛋白质与氨基酸的颜色反应总结,3.3、双缩脲反应,双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜-双缩脲络合物，称为双缩脲反应。在一定浓度范围内，反应后颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。反应产物在540nm处有最大光吸收。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。含有一个肽键和一个CSNH2，CH2NH2，CRHNH2，CH2NH2CHNH2CH2OH或CHOHCH2NH2等基团的物质也有此反应。NH3干扰此反应
3、，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。,双缩脲法测蛋白质浓度操作简便、迅速，蛋白质浓度与光密度的线性关系好，是蛋白质浓度分析的常用方法之一，但本法缺点是灵敏度低，蛋白质量须在1-20mg/mL测定结果较准确。在需要快速、但准确性要求不高的测定中常用此法。,3.4、茚三酮反应,C,2,C,H,C,C,C,O,O,H,O,H,2,C,C,O,O,H,R,C,C,C,O,O,O,H,O,H,还原茚三酮,茚三酮反应，即：所有氨基酸及具有游离-氨基的肽与茚三酮反应都产生蓝紫色物质，只有脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质。在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量
4、，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在.-丙氨酸、氨、许多一级胺呈正反应。在法医学上，使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹。因为手汗中含有多种氨基酸，遇茚三酮后起显色反应。,3.5、米伦氏反应（Millon反应）,苯酚及某些二羟苯衍生物中加入米伦试剂(硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物)后产生白色沉淀，可能是羟苯之亚硝基衍生物，经变位作用变成颜色更深的邻醌肟，最终得具有稳定红色的产物。含有酚基的化合物都有这个反应，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都能与米伦试剂反应。（溶液中不能含有大量无机盐、H2O2、醇或碱，因它们
5、能使汞变成沉淀，中和碱时不能用HCl）,3.6、黄色反应,含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橘黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。例如皮肤、指甲、毛发等遇浓硝酸变黄。,3.7 常用测定蛋白质浓度的方法,凯氏定氮法：样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨与硫酸作用，变成硫酸铵。经强碱碱化使硫酸铵分解出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据酸液被中和的程度计算含氮量。*6.25得蛋白质量双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白
6、质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。Folin-酚试剂法（lowry法）（福林-酚试剂法）：Tyr和Try能与福林酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比紫外吸收法：Tyr和Try在280nm处有最大吸收峰BCA法：在碱性溶液中，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与测定试剂中BCA（二喹啉甲酸）作用形成紫红色的复合物，在562nm处具有最大吸收峰。考马斯亮蓝法：当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595nm。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感性。甲醛滴定法：水溶液中氨基酸为两性
7、离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成-NH-CH2OH N(CH2-OH)2等羟甲基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基氮，从而算氨基酸的含量。缺点：不能滴定多种氨基酸的混合物、不能滴定pro、phe.优点：可确定蛋白质的水解程度，随着水解程度的增加，滴定值增加。,3.8、考马斯亮蓝法,考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染料，在游离状态下（G-250的磷酸溶液）溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm处。考马斯亮蓝G-250溶于醇和热水，微溶于冷水；考马斯亮蓝又称弱酸性
8、艳蓝6B，酸性条件下为红色，配成的贮备液是绿色，但调整溶液的酸度就会成为红色。一般R250用于染蛋白，G250一般测蛋白浓度，也可染胶，敏感性更高，但较慢脱色，R250较敏感，染色后为红蓝色当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收峰在595nm。考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水区结合，这种结合具有高敏感性。,蛋白质含量在0-100g范围内，蛋白质-色素结合物符合比尔定律，在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法进行定量分析。考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的蛋白质常用分析方法。,4、实验步骤,注：1、摇匀
9、；2、：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+，妨碍此颜色反应的观察；3、需先加NaOH，再加CuSO4，否则将产生蓝色的Cu(OH)2,使氨放尽,产生Cu(OH)2,茚三酮反应：取1支试管加入蛋白质溶液10滴，再加10滴0.1%茚三酮水溶液，混匀，在酒精灯上加热，观察颜色由透明到乳白色、红色，再到紫红色，再变蓝。注：此反应需在pH:5-7时进行黄色反应：取1支试管加入蛋白质溶液10滴，再加3-4滴浓硝酸，混匀，在酒精灯上加热，黄色，冷却后加4-5ml 10%NaOH，观察颜色变为橘黄色。,考马斯亮蓝法测蛋白质标准
10、曲线制作取7支试管，按下表操作。试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白溶液1(mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 样液1 1mL 卵清蛋白1ml0.9%NaCl溶液（mL）1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0 0考马斯亮蓝试剂(mL)4 4 4 4 4 4 4 4蛋白质浓度(g/mL)0 10 20 30 40 50？A595nm摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色 OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在Excell上绘制标准曲线。根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算：,双
11、缩脲法测蛋白质标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号 0 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白溶液2(mL)0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 样液2 3mL 卵清蛋白3ml蒸馏水（mL）3.0 2.7 2.4 2.1 1.8 1.5 0 0双缩脲试剂(mL)2 2 2 2 2 2 2 2蛋白质浓度(mg/mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5？A595nm充分混匀后，显色后30min内测定A540，否则会有CuO2形成。,6、讨论,1、反应现象,2、考马斯亮蓝法与双缩脲法测定蛋白质含量的标准曲线与样液浓度3、计算鸡蛋清的蛋白质含量4、两种测定方法的优缺点5、
12、其它测定蛋白质含量的方法的原理与优缺点,7、注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）考马斯亮蓝法测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。一些阳离子如K+、Na+、Mg2+等物质对测定无影响；而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定；乙醇的存在会使蛋白质沉淀，改变染料颜色（3）双缩脲法：本实验方法测定范围110mg/mL蛋白质。须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。,8 作业,预习实验28,
