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1、实验 双缩脲法测定蛋白质浓度,一、实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的原理和方法3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1原理,2主要方法：（1）比较吸收光谱曲线（2）比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。,（3）比较吸光度的比值 纯DNA,（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析,1原理Beer-Lambert（比尔）定律：T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系
2、数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度,2常用方法（1）标准曲线法标准曲线与样品的测定条件必须一致。,（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。（3）摩尔吸光系数法C=A/（为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。,四、分光光度计的使用,1722型分光光度计的外形,2.仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式“100%T/0ABS”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长,3.样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20
3、分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路 盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调100%透射比 按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度方式(A)将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零A 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。,返回,光路,返回,光路,返回,微量凯氏定氮法测定蛋白质总
4、含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在16%左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。,Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键(CONH)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试
5、剂(磷钼酸磷钨酸试剂)，蛋白质铜络合物能还原磷钼酸磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏1020倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。,总蛋白定量分析BCA（Bicinchonin
6、ic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是202000g/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20g/ml快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和
7、染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。,Coomassie Dye-Based 蛋白质定量,（二）双缩脲法测定蛋白质 H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 双缩脲双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围1-10mg,三、操作步骤1.取15支试管，按下表编号、加试剂,2.各管混匀后，加入双缩脲试剂3.0mL,37oC反应30min。3.以0号管调零，测定各管540nm光吸收值。,四、结果处理1.绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的计算根据样品的OD540从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（mg），再根据样品的体积计算出样品的浓度。五、注意事项1.须于显色后30min内测定，且各管由显色到比色时间应尽可能一致。2.*样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3.比色杯的使用,
