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1、第四章 化学物质成份的鉴定方法,第一节 化学鉴定法一、物理常数的测定 分离获得的化合物，首先鉴定属于无机物还是有机物。结晶性化合物，则需测熔点和比较旋光度。液体测沸点，比重，折光率等。1.熔点测定 化合物在大气压力下两态达成平衡而共存时的温度，即熔 点(MP.)。样品要求：干燥、纯度高。,样品干燥 a.常压干燥 b.减压加热干燥 c.干燥剂干燥 d.冷冻干燥 e.红外干燥法 f.真空干燥器抽气法,熔点测定方法 毛细管法：温度计 毛细管 b形管 浓硫酸 或甘油 显微熔点测定仪 优点：a.可测微量样品 b.可测高熔点样品 c.可观察样品加热过程中的变化,熔点测定中的一些问题 a.温度计的较正 b.
2、熔点不敏锐 c.无明显的熔点，易于分解的物质 d.没有固定的熔点但有分解点，软化点 e.复熔现象,有机化合物的熔点与分子结构的关系 a.同系列化合物直链的其熔点随分子量增加而增加 b.烃类衍生物熔点比相应烃要高 c.对称性高的比对称性低的熔点要高 d.取代苯中第一，第二类取代基各1时，熔点顺序 为：对位间位邻位 e.取代苯中两取代基为同一类取代基时,熔点顺序 为：对位邻位间位 f.氢键的生成对熔点的影响,2.沸点的测定 物质液气两态共存时的温度称为液体化合物的沸点，每种纯液体都有固定的沸点。作用：鉴定化合物，判断其化合物的纯度。常用方法：毛细管法 蒸馏法,沸点与分子结构的关系 a.同系物化合物
3、随-CH2-增加而增加 b.衍生物的沸点比母体高，其中以羧酸的为 最高。c.分子的对称性 d.同样在顺反异构体中，顺式的高，反式的低。e.有机化合物中有缔合现象的沸点升高 f.分子内作用力大小,3.比旋光度的测定 有机化合物的结构不对称时，分子与它的镜影不能相互重叠，而通过它的平面偏振光需偏转一定的角度，即产生旋光现象。影响旋光度的因素：a.样品的本质 b.样品的厚度 c.样品的浓度 d.溶剂的温度和波长。,4.比重的测定 估计化合物分子结构的复杂性，凡比重小于1.0的化合物通常不会含有一个以上的官能团，而含多官能团的化合物比重大于1。测定方法：a.比重瓶法 b.U型比重计法 c.比重天平法,
4、比重的一些规律:a.烃类比水轻 b.原子被取代则比重增大 c.烷烯炔 d.缔合能力越强,比重越大 e.多官能团取代一般比水重,5.折光率的测定作用：鉴定化合物的纯度，判断可能属于哪类化 合物。意义：表示光线在真空中与在被测物质中进行速 度的比值。测定仪器：阿贝折光仪,二、分子式的测定1.元素定性分析 确定有机物中元素的成分，减少官能团测定步骤，缩小分析范围，一般只测杂原子。实验室常用钠熔法。2.元素定量分析 元素分析仪 一般分析C，H，N。,3.实验式的计算 根据元素定量分析数据，确定各元素的组成比。原子比=百分含量/原子量 4.分子量的测定 质谱分析（出现分子离子峰的物质）混合熔点降低法：化
5、合物乙与甲混熔，使甲的熔点降低，熔点降低的幅度与乙的摩尔浓度成正比。缺点：样品用量大，准确度差,三、化合物功能基和分子骨架的推定 根据该化合物缺氢因素（分子式确定时已知）推断出双键数或环数，并结合物理常数，化学定性实验，UV，LR，NMR，MS谱的数据，综合分析，以确定化合物含有哪些功能基。四、官能团的检识 采用红外光谱可以找到某些常见的官能团。并参照有机定性分析。,五.衍生物的制备1.制备衍生物的目的 准确确定样品为何种化合物。2.生成衍生物应具备的条件a.有固定熔点（50-250C之间且与样品至少相差5C）b.易于制备，产率高，易精制纯化，试剂价廉易得 c.其物理常数最好文献上有记载，有色
6、谱光谱数据（若是有机物则有，未知物则无）,3.衍生物制备的方法a.烯烃衍生物的制备 b.芳烃衍生物的制备 c.醇衍生物 d.酚类衍生物的制备 e.醛酮类衍生物 f.糖类衍生物的制备 g.羧酸衍生物的制备 h.酯类衍生物的制备 i.缩醛衍生物的制备 j.胺类衍生物的制备,3，5-二硝基苯甲酸酯的制备,第二节 层析鉴定法,一、纸层析 根据移动的位置求出Rf值，进行定性鉴定。步骤:a.滤纸选择 b.点样 c.展开 d.定性检定,植物中化学成分多种多样，很多具有特殊的生理活性，而且结构还很复杂，因此植物化学成分的结构鉴定一直是化学家感兴趣的研究领域。早期的结构研究程序一般先采用多种化学方法将复杂的分子
7、降解为几个稳定的碎片，然后通过一些官能团的显色化学反应、理化常数的测定、元素分析或可通过合成证明的简单化合物来推测这些碎片分子，最后按降解反应的原理推到出原化合物可能的结构。,第三节 仪器分析鉴定,由于科学技术的进步，各种科学仪器的发明和普及，特别是由于紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、质谱（MS）、核磁共振谱（NMR）等近代物理方法的应用，是植物化学成分结构鉴定的方法发生了革命性的变化，并已成为植物化学成分结构鉴定的常规手段。,结构研究的程序,化合物纯度的测定和判断化合物类型的初步判断已知化合物的结构推断未知的植物化学成分的结构分析,一、化合物纯度的测定和判断,纯度检查的必要性植物化学成分
8、结构的准确鉴定必须建立在该成分分离纯化的基础上，可以说样品的纯度是能否获得准确信息的关键，否则可能得到混乱甚至错误的结论。纯度检查的方法晶型 熔点 溶程 色泽色谱方法（薄层色谱和纸色谱）,色谱方法要求：至少选择在三种溶剂系统中展开具体操作过程：首先在可见光或紫外光下观察，然后喷以适当的显色剂或在碘缸中显色，若为单一斑点，可判断其为纯化合物；对于个别情况，有时需要用正、反相色谱加以确认；在条件允许的情况下，也可利用气相色谱或高效液相色谱来证实。,二、化合物类型的初步判断,同科属（种）植物研究信息的调研样品在提取分离过程中的行为一般理化常数和性质酸碱行为、溶解行为、层析行为等特殊的显色反应碘化铋钾
9、可检测生物碱,三、已知化合物的结构推断,在实际工作中，判断化合物的结构并不需要测定完一个化合物的所有波谱数据，有些化合物特别是已知化合物，在化合物结构类型初步判断的基础上，结合文献调研，通过与标准品的理化常数、性质及薄层对照检查或一些简单的波谱（如红外光谱、紫外光谱数据）对照比较，即可做出判断。,四、未知的植物化学成分的结构分析,未知的植物化学成分，需要通过波谱的综合解析，还需要配合适当的化学、生物方法（主要是降解）来进行结构研究。一般地，要判断一个化合物的准确结构，往往需要通过多种波谱数据及理化常数相互印证，概括起来可以从以下几个方面入手：,1、分子量、分子式的确定,由分子式可计算不饱和度，
10、进而推测化合物的大致类型，如是否为芳香化合物，是否含有双键等。植物化学成分最可能的分子量、分子式可利用元素分析、质谱的分子离子峰（M）或其同位素峰（M+1）、（M+2）的相对强度来得到。另外，对于一些高极性或热不稳定的化合物，需用软电离方式，才有可能得到其质谱的分子离子峰。,分子离子峰molecular ion peak,分子电离一个电子形成的离子所产生的峰。分子离子的质量与化合物的分子量相等。,有机化合物分子离子峰的稳定性顺序：芳香化合物共轭链烯烯烃脂环化合物直链烷烃酮胺酯醚酸支链烷烃醇,同位素离子峰（M+1峰）isotopic ion peak,由于同位素的存在，可以看到比分子离子峰大一个
11、质量单位的峰；有时还可以观察到M+2，M+3。；,2、官能团、结构碎片或基本骨架的推断,紫外光谱共轭体系、芳香结构红外光谱提供许多官能团的特征吸收质谱提供分子结构中可能存在或可能失去的分子片段核磁共振谱提供较大的信息量，反映出组成分子的碳、氢骨架信息,3、测定分子的平面结构,综合光谱解析及官能团定性、定量分析的结果，结合文献调研，利用已确定的结构单元，可以推断分子的平面结构。注意：由此推测得到的化合物结构可能不止一种，应与已知的、结构类似的化合物的波谱数据间相互印证，最终选择出最可能的结构。有时还需做化学降解、衍生物制备或人工合成等化学沟通工作加以证实。,4、分子构型、构象主体结构的推断和确定
12、,分子的构型和构象主要通过测定偶极偶合谱（NOE）、二维和三维核磁共振谱、CD谱和旋光色散谱（ORD）等来进行研究。对于晶体化合物还可以用X射线衍射分析确定晶体结构。,第二节 结构研究的主要方法,波谱分析法是目前植物化学成分结构鉴定的主要方法，可分为：紫外-可见光谱法红外光谱法质谱法核磁共振谱法,紫外-可见光谱法,在植物化学成分的结构测定中，UV-VIS谱通常用于推断化合物的结构类型，特别是对分子中含有共轭双键、,-不饱和羰基结构及芳香体系化合物的结构鉴定。主要规律Woodword规则（估计取代共轭双烯的max值）Woodword-Fieser规则（计算取代的，不饱和羰基化合物max值）Sco
13、tt规则（估算取代苯衍生物RC6H4COZ的max值）,物质的紫外可见光谱显示的是分子中生色基团和助色基的特性，吸收峰的波长与分子中基团种类，数目及其相互位置有关。,紫外-可见光谱法应用,-紫罗兰酮和-紫罗兰酮,CH=CHCOCH3,CH=CHCOCH3,-紫罗兰酮的max值用Woodword规则计算为227nm，-紫罗兰酮的max值用Woodword规则计算为299nm。显然二者的UV谱有明显的区别，-紫罗兰酮由于双键共轭，其紫外吸收波长较-紫罗兰酮明显移到长波方向。,另外在某些情况下，如香豆素类、黄酮类化合物，它们的UV光谱在加入某些诊断试剂后可因分子结构中取代基的类型、数目及位置的不同而
14、发生改变，因此可以应用UV谱推断该类化合物的精细结构。,例如芦丁的甲醇溶液及加入各种诊断试剂后的UV谱如下：,试剂,甲醇,甲醇钠,三氯化铝,乙酸钠,max,谱带2,谱带1,259,272,275,271,359,410,433,393,O-Glu-Rha,O,OH,OH,HO,OH,O,A,C,B,芦丁的化学结构,甲醇钠是强碱，可使所有的羟基解离，进而使谱带1和谱带2均发生明显红移；三氯化铝可分别与B环的邻二酚羟基、C环的羰基和A环的5位羟基形成配合物，也能使谱带1和谱带2均发生明显红移；乙酸钠为弱碱，只能是酸性较强的A环7位羟基和B环4位羟基解离，使谱带1和谱带2均发生明显红移，但若与甲醇钠
15、。,红外光谱,红外光是电磁波的一种形式，波长在0.751000m之间，在波谱图中通常用波数表示，波数v与波长的关系为：v（cm-1）=1/=h/c通常在波谱分析中将红外光分为近红外、中红外和远红外三个波段，其中中红外区（4000400 cm-1）是有机化合物红外吸收的重要范围。,红外谱图按波数可分为6个区，其中波数大于1300 cm-1的区域是为官能团区，波数小于1300 cm-1的区域是为指纹区。从官能团区可找出该化合物存在的官能团，而指纹区的吸收则宜于用来与标准图谱或已知图谱进行比较，得出未知物与已知物结构相同或不同的确切结论。,（一）40002500 cm-1（X-H伸缩振动区）,羟基吸
16、收范围：36503200 cm-1游离羟基仅存在于气态或低浓度的非极性溶剂中，红外吸收出现在较高的波数（36403610 cm-1），峰形尖锐。缔合羟基易形成氢键相连的多聚体，键力常数（k）下降，红外吸收位置移向较低的波数（3300 cm-1附近），峰形宽而钝。,氨基氨基的红外吸收与羟基类似，游离氨基的红外吸收在35003300 cm-1范围，缔合后吸收位置降低约100 cm-1；伯胺有两个吸收峰，NH2有两个氢键；仲胺只有一种伸缩振动，只有一个吸收峰，其中芳香仲胺的吸收峰比相应的脂肪仲胺波数高；叔胺因氮上无氢，在这个区域无吸收。,烃基不饱和碳（双键及苯环）的碳氢伸缩振动频率大于3000 cm
17、-1，饱和碳（除三元环外）的碳氢伸缩振动频率低于3000 cm-1不饱和碳的碳氢伸缩振动可见四个吸收峰，其中两个属于CH3，两个属于CH2，由这两组峰的强度可大致判断CH3和CH2的比例。在进行未知物的鉴定时，还可根据红外图谱3000 cm-1处附近是否有吸收峰来鉴别无机物和有机物，其中无机物无吸收。,（二）25002000 cm-1（三键和积累双键的伸展振动区）,在这个区域，包括作图未能扣除空气背景中的二氧化碳（约2365 cm-1、2335 cm-1）的吸收峰和其他很小的吸收峰。由于此区间内出现的吸收较少，因此任何小的吸收峰都应引起注意，它们都可能提供结构信息。,（三）20001500 c
18、m-1（双键的伸展振动区）,红外图谱中重要区域羰基：19001650 cm-1碳碳双键：16751600cm-1苯环：1450cm-1、1500cm-1、1580cm-1、1600cm-1杂芳环：呋喃1600cm-1、1500cm-1、1400cm-1吡啶1600cm-1、1570cm-1、1500cm-1、1435cm-1,（四）15001300 cm-1,苯环、杂芳环、硝基等的吸收可能进入此区，该区域主要提供弯曲振动的信息甲基在约1380 cm-1和1460 cm-1同时有吸收，当前一吸收峰发生分岔时表示偕二甲基的存在，偕三甲基的红外吸收与偕二甲基相似。亚甲基CH2仅在1470 cm-1处
19、有吸收。,（五）1300910cm-1,所有单键的伸缩振动频率、分子骨架振动频率、部分含氢基团的弯曲振动和含重原子的双键（P=O，P=S等）的伸缩振动频率均在这个区域出现。,（六）910cm-1以下,苯环因取代而产生的吸收（900650cm-1）是这个区域的重要内容，是判断苯环取代位置的主要依据；另一方面，烯的碳氢弯曲振动频率也处于本区及前一区，也可以根据此区的信息判断双键的取代类型。,1、判断苯环的取代类型单取代：两个峰，分别出现在770730cm-1，710690cm-1二取代：邻位：单峰，出现在770735cm-1间位：三个峰，分别出现在810750cm-1，725680cm-1，900
20、860cm-1对位：单峰，860800cm-1,2、双键取代类型的判别RCH=CH2：两个峰，分别出现在990cm-1和910cm-1（强）RCH=CHR：顺式：一个峰，690cm-1（较弱）反式：一个峰，960cm-1（较强）R2C=CH2：890cm-1R2C=CHR：840790cm-1,注意！,在解析解析红外谱时，要同时注意红外吸收峰的位置、强度和峰形，对于任意一个官能团来讲，由于存在伸缩振动和多种弯曲振动，因此任何一种官能团会在红外图谱的不同区域显示出几个相关的吸收峰。所以，只有当几处应该出现吸收峰的地方都显示吸收峰时，方能得出该官能团存在的结论。,质谱,质谱法（MS）的灵敏度远远超
21、过其他方法，测试样品的用量在不断降低，而且分析速度快，可同具有分离功能的色谱联用，是唯一可以确定分子式的方法。,质谱的基本原理具有一定压力的气态有机分子，在离子源中通过一定能量（70eV）的电子轰击或离子分子反应等离子化方式，使样品分子失去一个电子产生正离子，还可裂解为一系列的碎片离子，然后根据粒子的质荷比（m/ze）的不同，用磁场或磁场与电场等电磁方法将这些正离子进行分离和鉴定。由于多电荷离子产生的比例比单电荷离子小的多，通常z等于1，e为1个电子的电荷是一个常数，这样，质谱就成为产生并称量离子的装置。由于各化合物所形成的离子的质量以及各种离子的相对强度都是各化合物所特有的，故可从质谱图形中
22、确定分子量及其结构。,核磁共振谱,核磁共振现象最早是在1946年观察到的，大约从1960年以来被常规地应用于有机化合物的结构鉴定；20世纪70年代，随着傅里叶变换核磁共振（FT-NMR）成为常规手段以后以及各种脉冲序列的应用，使这个领域的发展更加迅速；可以说，核磁共振谱现已成为有机化合物结构鉴定中最活跃、最有利和不可缺少的一部分。,核磁共振氢谱（1H NMR）,核磁共振氢谱记录有机分子中各质子在外加磁场中受照射频率作用后所产生的不同的共振频率（用化学位移表示）化学位移：一般以四甲基硅烷为内标，测定各质子共振频率与它的相对距离，这个相对距离值就是化学位移，常用表示。1H NMR测定中通过化学位移
23、、裂分情况以及积分曲线高度可以判断分子中1H的类型、数目及相邻原子或原子团的情况。,影响化学位移的因素,化学位移是由氢核外电子对核屏蔽作用引起的，1H核因周围化学环境不同，其外电子密度以及绕核旋转时产生的磁屏蔽效应也不同。因此，凡是能使氢核外电子云密度改变的因素都能影响化学位移。取代基的电负性磁各向异性共轭效应,不同类型氢核化学位移的大致范围,烷基氢,炔氢,烯氢,芳环及芳杂环氢,醛基氢,活泼氢,类 型,-CH3-CH2-CHR-CH（)-CH()R为OH，OCOR，OR，XR为C=O，C=C，Ar,CH,=CH,（OH，SH，NH）,CHO,0.81.211.51.21.8在上列数据基础上-H
24、：+（24）-H：+（12）-H：+（12）-H：+（0.51）,23,58,69,910,不定，加入重水后消失,核磁共振碳谱（13C NMR）,与1H NMR相比，13C NMR 可以获得有关有机分子骨架最直接的信息，但测定灵敏度只有1H NMR的1/6000，致使13C NMR 长期以来不能投入实际应用。脉冲傅里叶变换核磁共振装置（pulse FT-NMR）的出现和计算机的引入基本解决了13C NMR 存在的弊端，并使13C NMR 得到广泛应用，成为有机化学结构鉴定的有力工具。,FT-NMR的简单原理,FT-NMR装置采用强的脉冲照射使分子中所有的13C核同时发生共振，生成在弛豫期内表现
25、为指数方式衰减的正弦信号，在经傅里叶变化即成为正常的NMR信号，随着脉冲扫描次数的增加及计算机的累加计算，13C信号将不断得到增强，噪声则越来越弱。经过成千上万次的扫描及累加计算，最后即可得到一张峰形良好的13C NMR 谱。,13C信号的化学位移,对碳谱而言，最重要的信息是化学位移，13C NMR 谱与1H NMR 谱不同，化学位移的幅度较宽，约为220，信号之间很少重叠，识别起来比较容易。影响13C信号的化学位移的因素：碳的杂化诱导效应共轭效应分子内的相互作用,与1H NMR一样，13C的信号化学位移也取决于周围的化学环境及电子密度，改变某个13C核周围的化学环境或电子密度，该13C信号即可发生位移；常见的13C的信号化学位移有苯的取代基位移、羟基的苷化位移、酰化位移等，在结构研究中均具有重要意义。,实例,
