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1、基因工程原理和技术,概念：基因工程，又叫基因拼接技术或DNA重组技术，它是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞中，定向的改造生物的遗传性状。,一、基因工程的操作步骤：目的基因的获取；形成重组DNA分子；重组DNA 导入受体细胞；筛选含有目的基因的受体细胞；目的基因表达。,1.第一步：目的基因的获取,（1）方法：从基因文库中获取目的基因 利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目的基因（目的基因的序列已知）化学方法合成目的基因（目的基因的序列已知）,从基因文库中获取目的基因,用限制酶切成许多片断,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入受体菌的群体
2、储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。,聚合酶链式反应（PCR技术）,变性：双链DNA解链成为单链DNA复性（退火）：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,1.变性升温至95,2.复性降温至60,引物与母链结合,3.延伸升温至72,DNA聚合酶,解旋,PCR技术与原理,Taq DNA聚合酶有耐高温的特点,思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？,聚合酶链式反应(PCR技
3、术)扩增,原理：,目的：,前提：,条件：,DNA复制,获得大量的目的基因,有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。,模板DNA（目的基因）,耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶),四种脱氧核苷酸,两种DNA引物,人工合成基因的方法,反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA,化学方法合成目的基因,化学方法合成目的基因,通过化学合成的目的基因是否含有粘性末端？,大片段DNA,打成许多小片段,小片段DNA,目的基因,载入运载体,细菌,重组DNA分子,重组DNA分子,例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因,如果运气不好，在打成小片段时，有可能把抗虫基因打断,如何从基因文库
4、中获取目的基因?,大片段DNA,打成许多小片段,小片段DNA,目的基因,载入运载体,细菌,重组DNA分子,重组DNA分子,基因组文库,对基因组文库的所有细菌进行逐一筛查找出有抗虫蛋白的菌落该菌落所携带的基因片段就含有目的基因,例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因,容易吗？,2、形成重组DNA分子（构建基因表达载体),基因表达载体的组成,启动子,目的基因,终止子,复制起点,标记基因,通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。,3、将重组DNA导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆
5、菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1.将重组DNA导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,2.将重组DNA导入动物细胞,显微注射技术（最多、最有效）,3.将重组DNA导入微生物细胞,Ca2+处理，以增加细菌细胞壁的通透性。,（1）将重组DNA导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,（2）将重组DNA导入动物细胞,显微注射技术,提纯基因表达载体,将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子,（3）如果是导入微生物（如细菌）,感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。处于感受态的细胞称为感受态细胞.,CaCl2,0,重组载
6、体,感受态细胞,42,四环素抗性基因,目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有少数导入的是重组质粒。,4.筛选含有目的基因的受体细胞,目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记：如以质粒做为载体可进行抗性的检测,原理：质粒上有抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选,思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,没有质粒,含目的基因的质粒,正常质粒,检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因（关键）,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质（表达）
7、,（2）常用的技术：DNA分子杂交技术蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交,5.目的基因的表达（1）内容：,（2）基因工程的的原理及技术,分子水平：DNA分子杂交技术,核心DNA探针,目的基因的脱氧核苷酸（单链）序列片段,用荧光分子或放射性同位素标记,看能否形成杂合的双链区,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定等,过程:A.首先取出转基因生物的基因组DNAB.用含目的基因的DNA片段(单链)用放射性同位素等作标记,以此做探针C.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入
8、染色体DNA中,过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA.,目的基因与质粒的连接,基因DNA文库的构建 将总DNA经过酶解，分离不同长短的DNA片段。包含的基因片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，感染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因文库。,基因探针：,基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，
9、形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,基因探针（DNA探针）与目的基因杂交，有无杂交带,传统的遗传育种方法有哪些？传统的遗传育种方法能否解决不同种生物优良性状的重组问题？基因工程技术如何解决不同种生物优良性状的重组问题？,基因工程的应用,基因工程的应用,一、基因工程与作物育种,二、基因工程与疾病治疗,（）基因工程药物,（2）基因诊断,（3）基因治疗,三、基因工程与环境保护,基因工程的应用,一、基因工程与作物育种,1.抗虫转基因植物,2.抗病转基因植物,3.其他抗逆转基因植物（如抗盐、抗旱、抗除草剂植物等）,4.利用转基因改良植物的品质,基因工程在农业上的应用：1）高
10、产、稳产和具优良品质的品种2）抗逆性品种,基因工程在畜牧养殖业上的应用:,基因工程与疾病治疗,基因工程药品的生产,在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？,药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。,传统生产方法的缺点,由于受原料来源的限制，价格十分昂贵。,可利用什么方法来解决上述问题？,利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,基因工程胰岛素,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,胰岛素分子结构,基因工程胰岛素,将合成的胰岛
11、素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!,胰岛素生产车间,基因工程干扰素,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。,干扰素生产车间,干扰素分子结构,SCID的基因工程治疗,重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。,SCID患者生存在无菌环境中,基因治疗SCID的过程,基因工程与生态环境保护,基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。,通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。,
