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1、水产品兽药残留检测技术,主要内容,兽药残留概述前处理技术液质分析残留方法的建立步骤方法验证能力验证思路和经验,水产品兽药残留分析概述,兽药残留（animal drug residues）是指给动物使用药物后蓄积或贮存在细胞、组织或器官内的药物原形、代谢产物和药物杂质。,水产品兽药残留分析概述,农业部193号公告兽药禁用清单有21类，包括硝基呋喃类，孔雀石绿类，氯霉素类，汞制品类等，出口水产品重点监测的兽药还包扣磺胺类，喹诺酮类，大环内酯类，青霉素类，四环素类等。出口指定的兽药检测项目要求不得检出。,水产品兽药残留分析概述,兽药残留超标的主要原因1、非法使用违禁药品2、不遵守休药期，中国兽药典。
2、3、其他原因如饲料加工的交叉污染，动物个体代谢差异等。,水产品兽药残留分析概述,对兽药残留实施监控是一种复杂的系统工程，包括从药物研制、注册登记、生产、使用及食品和环境监测等诸多环节。建立残留分析方法和制定最高残留限量、休药期是最基本的方面。目前国内颁布的法定检测方法还缺乏系统性和完善性，其他危害性比较大，特别是出口欧盟产品必须要检测的品种如抗甲状腺制剂、类固醇类、硝基咪唑类药物、精神类药物、抗蠕虫药物、环境污染物等的检测方法尚在研究之中。2002年农业部再次对已发布的兽药最高残留限量标准进行了修订并重新发布，此次共规定了134种兽药的动物性食品中兽药最高残留限量标准。随着兽药科技的发展，新兽
3、药品种还会不断出现，因此需要不断地制定和修订在水产品的兽药最高残留限量规定及相应的残留检测方法。,兽药残留检测概述,兽药残留检测涉及到稳定性试验方法，提取方法，净化方法，测定方法(分离方法检测方法)。,1.文献检索 文献检索仅能显示最适宜的分析方法可能是什么，提供样品处理，分离和检测方面粗略信息，进行方法的比较和借鉴，调整具体的实验条件，改进和建立符合要求的新方法。如针对新对象或采用新技术，可以从较早的化学合成文献得到待测物的物理性质或分离方面的原始资料，或从具有相近结构或官能团化合物的方法方法中获得某些信息和提示。有现成标准方法的采用现成标准方法（验证）。2.建立测定方法 建立测定方法和线性
4、范围，为后续的各种工作提供分析手段，最后根据干扰和使用情况逐步确立测定条件和建立标准曲线。如兽残及代谢物属中等极性或较高极性化合物，不能直接进行GC分析，HPLC常用的检测器有紫外（UVD），荧光（FLD，共轭双烯）,电化学（EehlD）。MS为非常规检测器。,兽药残留检测概述,3.建立样品处理方法 提取，净化，衍生4.标准曲线 LC-MS/MS要求设4个点，相关系数大于0.995，有外标（基质匹配法）和内标，标准加入法，基质匹配法。5.稳定性试验 一般包括标准溶液（溶剂）和样品中贮存条件下的稳定性试验，如室温，冷冻，反复冷冻-解冻条件下的稳定性。6.方法评价 准确度，精密度，灵敏度等。,兽药
5、残留检测概述,样品处理方法涉及的因素很多，操作复杂，方法灵活，直接影响各项分析指标、成本和效率，一般占70%的分析工作量。,水产品兽药残留检测样品前处理技术,常用的提取溶剂有乙腈，甲醇，丙酮，这些溶剂与水，稀酸，稀碱的混合溶剂如乙腈-甲醇，氯仿-甲醇，乙腈-水，或酸化，碱化等。乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚和叔丁基甲醚。叔丁基甲醚可代替卤代溶剂。,1、提取溶剂的选择,水产品兽药残留检测样品前处理技术,乙腈，甲醇，丙酮与样品容易结合，溶剂化作用和渗透能力强，粘度小，提取速度快，能使结合态的药物释放，提取的同时脱蛋白脱脂，PH值可调，待测物分布均匀。但提取的杂质较多，进一步萃取乳化严重，效果相似，
6、甲醇提取液的杂质最高。“万能溶剂”DMSO沸点高极少用。在酯溶性的残留物中，采用非水溶性极性溶剂，乙酸乙酯，氯仿，二氯甲烷，乙醚。加无水硫酸钠，盐析提高回收率。干样（含水小10%）加水增强提取。,1、提取溶剂的选择,均浆提取法；震荡法；索氏提取法（考虑热稳定性，适合水分少如饲料样品，水产品组织要和海砂或无水硫酸钠一起研磨成干粉）；超声波提取（SAE，空化作用，增加溶解，时间不能长，发热）；超临界流体萃取（SFE），强化溶剂萃取（ASE）和微波辅助萃取（MAE）,2、提取方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,超临界流体密度与液体相似，但是溶质在其中的扩散系数比液体中大得多。极性低的碳氢化合物，
7、醚，酯，环氧化合物，可以在低压力下提取（7-10MPa）进行萃取，羟基，羧基难萃取，一个羧基和两个羟基的化合物和三个酚羟基的苯环衍生物可以被萃取；40 MPa以下，糖和氨基酸都不能被萃取；分级极性差异和挥发性差异。,2、提取方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,超临界流体萃取仪流体源，加压装置，控温装置，萃取容器，节流装置，收集装置。CO2作为流体操作温度低，利于热不稳定的化合物，组分中不含氧，防止氧化。,2、提取方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,液-液萃取LLE LLE利用待测组分与样品杂质在互不相溶的两相中溶解性差异进行净化。设计的基础为：极性组分与非极性组分；极性物质再分成酸性，
8、中性，碱性物质。正己烷（石油醚）-乙腈；正己烷-甲醇；正己烷-丙酮；异辛烷-80%丙酮；氯仿-水；乙酸乙酯-水。影响因素：溶剂，PH值（磺胺，喹诺酮，苯并米唑类，苯乙胺类等）,3、净化方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,液-液萃取操作方法 分液漏斗震荡，漩涡萃取，逆流萃取，特殊容器萃取。从水相中提取药物时溶剂中常带如少量的水分，可干扰固相萃取，延长浓缩时间和增加杂质，加无水硫酸钠脱水。高极性的药物在净化中发生吸附，硅烷化玻璃器皿（1%三甲基氯硅烷的甲苯溶液淌一次，100下干燥30min）；加异丙醇或二乙胺也能降低吸附。,3、净化方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,固相萃取（SPE）采用
9、固相萃取小柱作为分离媒介，小柱中添加了不同填料的固定相，以键合硅胶为基质的C18、NH2、COOH、PSA、SAX等，是硅胶的表面活性大为降低，最大程度的降低了极性化合物的不可吸附和拖尾，使样品回收率和重现性得到保障；以高分子聚合物为基质的如PEP、HXN、PAX、PCX等，具有高纯度、高比表面的特点；以吸附型填料为固定相的如硅酸镁、氧化铝等，主要通过表面的极性吸附达到分离的目的。因此，固相萃取法适用于各种极性的化合物,3、净化方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,固相萃取（SPE）,3、净化方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,固相萃取（SPE）操作步骤：活化，上样，洗涤，洗脱。其他方法
10、固相微萃取：固液吸附平衡制备色谱法：制备HPLC分析激素残留凝胶渗透色谱法：分子筛作用膜分离技术：硝酸纤维，醋酸纤维等半透膜基质固相分散技术：样品和填料的比例是1：4免疫亲和色谱：连接有抗体的惰性基质做固定相，选择性吸附。分子印迹技术：印迹聚合物，塑料抗体,3、净化方法,水产品兽药残留检测样品前处理技术,旋转蒸发：溶剂可回收气流吹蒸：少量溶剂K-D浓缩器：浓缩，回流，洗涤，定容真空离心：热敏性组分，粘稠液体再溶解使用流动相的初始比例作溶剂,4、浓缩富集及再溶解,水产品兽药残留检测样品前处理技术,步骤1.确立质谱条件2.建立LC方法3.内标选择4.前处理方法选择,建立液相色谱串联质谱定量分析方法
11、,文献检索：了解化合物的性质包括化合物的结构、化合物的极性及化合物的pKa值。首先了解化合物的结构，可大概的推断其碎片离子的断裂方式，选择较为稳定的碎片离子作为定量的子离子，也可以根据经验判断选用哪种离子源更为合适；根据化合物的极性大小，可以选择一种或几种恰当的溶剂作为溶媒，既能保证完全将样品溶解，又能提高化合物的质谱响应；化合物的pKa值，有助于选择流动相的添加剂及其pH值，从而提高质谱响应。,建立液质定量分析方法,建立液质定量分析方法,1.连接管路 2.选择Q1MS扫描模式和Full Scan扫描类型 3.设置离子源参数 4.将流动相导入质谱仪，观察到待测化合物的准分子离子峰峰强度在10的
12、6次方左右。,1、确立质谱条件（化合物优化）,建立液质定量分析方法,5.选择MS Only优化模式和Syringe Pump Infusion入口类型选项 6.优化Tube Lens Offset、Spray Voltage、Sheath Gas Pressure、Aux Gas Pressure获得待测化合物稳定的准分子离子峰。7.选择MS+MS/MS优化模式设置Parent Mass、Charge State和Num Product对子离子进行优化。8.MRM优化模式优化Tube Lens Offset和Collision Pressure9.记录并保存子离子全扫描质谱图。保存Tune M
13、ethod文件。,1、确立质谱条件（化合物优化）,建立液质定量分析方法,1、确立质谱条件（化合物优化）,建立液质定量分析方法,1、确立质谱条件（化合物优化）,建立液质定量分析方法,2、确立LC条件,在液相-紫外检测中，使用的添加剂的种类繁多，可以是挥发性的酸或者碱（如甲酸、乙酸和氨水等），也可以是不易挥发的缓冲盐（如磷酸二氢钠-磷酸缓冲液、磷酸二氢钾-磷酸缓冲盐）。但是在液质分析中，基于质谱检测的原理，我们只能使用可挥发的酸碱或缓冲盐，那么种类就会受到极大的限制。在日常分析中使用到的添加剂主要有甲酸、乙酸、三氟乙酸、氨水和甲酸铵、乙酸铵等缓冲盐。三乙胺在紫外检测中，常作为扫尾剂，但是在液质检测
14、中是绝对禁止的。因为三乙胺进入质谱后不易清除，残留及其严重，能够抑制离子的响应。在液相色谱紫外检测中，要求化合物之间R1.5，进行定量，那R最好2.0，要求准确的配制流动相，精确的调好流动相的pH及添加剂的浓度。但在液质分析中，我们经常使用多反应监测（MRM/SRM）对化合物进行定量，由于MRM要求选择两次离子，因此它具有很高的专属性，基于这点我们对多个化合物同时进行检测时，不需要彼此间达到完全分离就可以对他们进行定量分析。,建立液质定量分析方法,2、确立LC条件,由于生物样品中含有大量的基质，这些基质的存在会严重的干扰和影响化合物的测定，因而我们需要利用色谱将化合物与基质分开，从而降低基质效
15、应的影响，即降低离子抑制。待测化合物要在色谱柱上有保留，并且适当延长保留时间。三聚氰胺最好用离子柱。,建立液质定量分析方法,3、内标选择,内标工作方式：在每个样品、标准和空白中加入测定到每个样品中内标的响应根据实际测定内标响应值与预期内标响应值的比值来校正其他化合物的信号用分析信号和内标的比作标准曲线或乘校正因子或除内标回收率计算未知样品的分析信号和内标的比值并从标准曲线中读出信号,建立液质定量分析方法,3、内标选择,1.样品中不存在或者可以忽略2.没有受到质谱干扰3.没有对分析对象产生质谱干扰4.不容易受到环境污染5.和分析对象质量数接近（氘代物）6.离解方式和分析对象接近,建立液质定量分析
16、方法,能力验证经验及基质效应,为什么要采用LC-MS考核化合物的含量越来越低基体越来越复杂药残的能力验证建议的第一方法例如：干鱼粉中的恩诺沙星和环丙沙星鱼肉中的氟苯尼考,能力验证经验及基质效应,考核中的质量控制方法控制样品空白 平行双样测定或三样 加标回收标准参考物质的同步分析重复测定和仪器比对,能力验证经验及基质效应,加标回收：可分为前处理加标回收和上机加 标（单点标准加入）,能力验证经验及基质效应,加标回收：可分为前处理加标回收和上机加 标（单点标准加入）加标回收接近100不能代表考核结果完全准确无误。不能检查标准物质本身所带来的误差；不能检查加和性干扰，如污染和质谱干扰；,能力验证经验及
17、基质效应,标准参考物质的同步分析：选择基体和浓度相似的标准参考物质同步进行分析作用：标准是否合格样品前处理是否合适测定中是否存在干扰目前药残的标准参考物质很难购买，对于固体的国家一级标准物质，即使不能购得，也要尽量收集到证书。,能力验证经验及基质效应,其他质控方法不同仪器的比对实验 不同仪器在一定程度可考察基体和质谱的干扰状况重复分析和人员比对实验尽量消除过失误差和随机误差以上的质量控制方法在考核中应尽量多采用,能力验证经验及基质效应,考核前准备确认色谱柱柱效各流动相充足清洗锥口重新调谐校正仪器总之就是使仪器处于良好状态,能力验证经验及基质效应,预试验稀释到一定(或要求)的倍数后测定稀释成多种
18、稀释倍数 有利于多项目的测定使浓度在标准曲线的中间点有利于发现干扰有利于防止污染,能力验证经验及基质效应,定容 要考虑溶剂的匹配。测定 每个样品测定23次，同时分析标准参加物质并分析加标样品。数据处理 查看校准曲线是否符合要求确定是不同质量数测定结果是否相同尽量不同超过标准曲线的范围，如超过应稀释后测定。,能力验证经验及基质效应,基质效应成因待测组分与基质中内源性物质共洗脱而引起的色谱柱超载所致，这些成分常因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。待测组分与生物样品中的基质成分在雾滴表面离子化过程中的竞争。由于基质中某些干扰组分的存在会使待测组分离子生成的速度同
19、标准样品相比有显著不同，使得信号响应值产生较大变异。离子的有效淌度受到周围离子的影响，由其周围离子所形成的包围圈，称为离子基体。如果样品组分从进样点到探测点迁移过程中，在某一时间间隔遇上一个不同组成的基体区带，这个离子基体区带就将对样品组分产生影响，使它们的淌度发生瞬时变化，从而选择性地影响溶质的迁移和分离，这就是瞬时离子基体效应。分为离子抑制和离子增强,能力验证经验及基质效应,基质效应的评价：1.用流动相配制高中低三个浓度的待测物，并加入内标，测得响应值。2.空白基质提取后加入相同浓度的待测物和内标，测响应值。基质效应=空白基质响应值/流动相响应值100 这样不同浓度的待测物的基质效应和内标
20、的基质效应均可得到。,能力验证经验及基质效应,基质效应消除方法 1.选择合适的样品制备方法，对于不同的样品制备方法，不能简单地说某种方法优于另一种方法，每种组分对基质效应的敏感度不同，其适宜采用的样品制备方法也不同，要通过实验来确定。2.改善色谱分析条件：采用反相色谱分离，适当地增加待测组分的保留时间；减少进样体积；3.优化质谱分析条件，源的选择 4.选择内标。5.基质匹配定量,仪器维护,一、LC泵：使用buffer后的清洗。2、泵120L 流动相（或渗漏）时更换活塞密封圈，清洗液从部件中渗漏更换活塞。3、流速不对，或RT不稳时更换wash seal，柱压过高时更换line filter fr
21、it，流速不稳或有气泡时更换流动相瓶中的filter，drain valve渗出溶剂时更换更换drain valve O-ring4、泵不能启动时更换保险丝,仪器维护,二、自动进样器：1、检查管路及连接处（查漏），跑一针标准品。2、更换转子密封圈，更换the flush solvent inlet filter更换针座。3、清洗针或堵了的管线，更换syringe，更换进样环4、清洗、润滑syringe驱动系统，清洗、润滑xyz arm，校正xyz系统。,仪器维护,三、质谱：1、每周清洗管路及API源，清洗Ion sweep cone和离子传输通道。取下离子传输通道清洗，更换离子传输通道。2、APCI/ESI源：sample tube破裂、堵塞或增长时更换sample tube，割短sample tube。3、散热风扇：清洗风扇过滤器。清洗防尘罩。,仪器维护,四、机械泵：1、每天检查泵油。检查机械泵体温度。2、加油、换油。五、除尘防锈，维护USP电源。,
