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1、第六章 兽药残留检测技术,第一节 兽药残留,使用兽药的目的,防治食品动物疾病促进生长提高饲料利用率传统的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是, 随着集约化养殖生产的开展,一些化学的、生物的药用成分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂, 也属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、提高生产性能、改善动物性食品的品质等。,兽药的使用情况,据19661974年统计,美国大约已有78%80%的食品动物,在其一生中或多或少服用过药物。目前,不少国家所有的食品动物几乎都接受过某种化学治疗剂或预防剂。在集约化畜牧业生产发展的同时,用于促进生长、同步发情等非治疗用途的药物的品种和数量也
2、在不断地增加,用作治疗或预防的兽药及化学药品被广泛地用作饲料添加剂,以促进生长,提高饲料的转化率,控制生殖周期及繁殖性能,增进饲料的适口性及改善动物性食品对人的口味。,兽药的残留,兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位g/kg, 以鲜重计）。兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期过短, 是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市的间隔时间。,兽药的危害,由于粮食生产及发展畜牧业的需要
3、，大量应用药物及化学药品，人类一生中不断与食物中的药物及化学残留物接触，无疑会引起过敏、致畸、致突变及致癌等不良反应。由于饲料药物添加剂特别是亚治疗剂量的各类抗生素在畜牧生产中的广泛应用,畜产品中残留的药物对于环境及公众健康构成的潜在危害已成为严重的问题,给兽药行业的发展带来了恶劣影响。,立法机构,由于兽药用量增大,特别是饲料药物添加剂(简称药物添加剂)的广泛应用,伴随产生的食品动物(food prodcing animals)组织和产品中药物残留对消费者的健康和环境的潜在危害也日趋严重,因此兽药及药物添加剂的管理越来越受到各国农业及卫生部门的重视,动物性食品中的兽药残留问题已得到国际有关组织
4、高度重视,并为减少兽药残留对公众健康的危害作了不少的工作,采取了许多控制残留的措施。兽药在食品中的残留问题受到了食品法典委员会(CAC)、食品添加剂法典委员会等有关国际性组织的高度重视。,立法,为防止动物性食品中可能出现的药物残留损害人体健康,1984年在CAC的倡导下由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合发起组织了食品中兽药残留立法委员会(CCRVDF)。CCRVDF的主要宗旨是:为控制食品中的兽药残留,筛选并建立适用于全球的兽药及其他化学物残留的分析方法和取样方法;对兽药残留进行毒理学评价;按制订世界或地区性法规标准 (Codex Standart)的8个步骤,制定动物组织
5、及产品中兽药最高残留限量(MRL)法规及休药期法规。,一、常见兽药,按用途分类,抗微生物药,抗寄生虫药,激素类药物,生长促进剂,抗菌药：磺胺药、呋喃类药、喹诺酮类,抗病毒药：干扰素,抗蠕虫药,抗原虫药,杀虫药,抗生素：青霉素、链霉素、氯霉素,1、抗微生物药,抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺药及其他化学合成抗菌药。,根据化学结构可分类为:,(1)氨基糖苷类： 链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、安普霉素等。(2) -内酰胺类： 青霉素、头孢菌素等。(3)四环素类： 土霉素、金霉素、多西环素等。(4)氯霉素类： 氯
6、霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。 (5)大环内酯类： 红霉素、吉他霉素、泰乐菌素等。(6)林可胺类： 林可霉素、克林霉素。(7)多肽类： 杆菌肽、黏菌素等。,(8)多烯类：两性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺类及抗菌增效剂： 磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲基异唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹诺酮类：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、诺氟沙星、环丙沙星、奥比沙星、沙拉沙星、马波沙星等。,2、抗寄生虫药,抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫的药物。畜禽寄生虫病的危害性极大,会给国民经济造成无法估量的巨大经济损失。寄生虫病不
7、仅引起大批畜禽死亡,而且严重影响动物生长率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜产品质量下降,数量减少。某些人畜共患寄生虫病,还能直接威胁人类的健康和生命安全。,根据药物作用的特点，抗寄生虫药可分为:,(1)抗蠕虫药： 苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、有机磷酸酯类、四氢嘧啶类、水杨酰苯胺类、阿维菌素类、哌嗪衍生物等。(2)抗原虫药： 聚醚类离子载体抗生素、三嗪类、二硝基类、氯羟吡啶。(3)杀虫药： 有机磷化合物、拟除虫菊酯类化合物等。,3、激素与其他生长促进剂,(1)性激素动物生产中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睾丸酮、丙酸睾酮、氯睾酮)。(
8、2)生长激素 是由动物脑垂体分泌的天然蛋白质激素,主要通过促进蛋白质合成和脂肪分解来促进动物生长,增加瘦肉率,提高饲料转化率。目前在畜牧业生产中使用的主要有牛生长激素(BST)和猪生长激素(PST)。,(3)甲状腺素,类甲状腺素及抗甲状腺素。(4)人工合成的蛋白质同化激素 人工合成的蛋白质同化激素可促进动物脑下垂体生长激素的分泌。与抗生素一样,伴随着激素活性物质在畜禽生产中的使用种类和数量的不断增加,反对使用的呼声也越来越高。(5)镇静剂和-肾上腺素阻断剂 为了控制被运输及等待屠宰的动物的紧张,有些畜牧业会非法使用镇静剂和肾上腺素阻滞剂。因为猪对于它们所处环境的突然变化特别敏感,随之产生的新陈
9、代谢和紧张会影响肉的质量。,二、常见兽药残留的种类与危害 1. 抗生素类药物,多为天然发酵产物, 是临床应用最多的一类抗菌药物, 如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应, 四环素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反应等, 极度超敏反应可能导致过敏性休克, 甚至死亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食品, 可损害听力及肾脏功能。,2. 磺胺类药物,主用于抗菌消炎, 如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶, 磺胺眯, 菌得清、新诺明等。近年来, 磺胺类
10、药物在动物性食品中的残留超标现象, 在所有兽药当中是最严重的。长期摄入含磺胺类药物残留的动物性食品后, 药物可不断在体内蓄积。磺胺类药主要以原形及乙酸磺胺的形式经肾脏排出, 在尿中浓度较高, 其溶解度又较低, 尤其当尿液偏酸性时, 可在肾盂、输尿管或膀眈内析出结晶, 产生刺激和阻塞, 造成泌尿系统损伤。引起结晶尿、血尿、管型尿、尿痛、尿少甚至尿闭。,3. 硝基呋喃类药物,主用于抗菌消炎, 如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。通过食品摄入超量硝基呋喃类残留后, 对人体造成的危害主要是胃肠反应和超敏反应。剂量过大或肾功能不全者, 可引起严重毒性反应, 主要表现为周围神经炎、药热、嗜酸性白细胞增多、溶
11、血性贫血等。长期摄入可引起不可逆性末端神经损害, 如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等, 我国尚未制定硝基呋喃类药物残留检测国家标准。,4. 抗寄生虫类药物,主要用于驱虫或杀虫, 如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。食用残留有苯并咪唑类药物的动物性食品, 对人主要的潜在危害是其致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕妇有可能发生胎儿畸形, 如短肢、兔唇等; 对所有消费者来说, 可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色体畸变, 从而其后代有发生畸形的危险。,5. 激素类药物,主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度
12、, 使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素(包括多种内源性性激素、人工合成的类似性激素的类固醇化合物、人工合成的具有性激素某些特性的非类固醇化合物) 最常用, 如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮, 丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。正常情况下, 动物性食品中天然存在的性激素含量是很低的, 因而不会干扰消费者的激素代谢和生理机能。但摄入性激素残留超标的动物性食品, 可能会影响消费者的正常生理机能, 并具有一定的致癌性, 可能导致儿童早熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。,在畜牧业中,激素常作为饲料添加剂或埋植于动物皮下,达到促进动物生长发育(促生长幅度可以提高10%40%),增加体重,促进动
13、物发情等目的,结果导致动物食品中激素残留。当大量使用性激素及其衍生物以后,这类化合物可在动物体内残留,而且很稳定,不易分解,给人类健康带来危害。我国、欧盟和美国等已禁止对食品动物使用己烯雌酚及其盐、酯制剂;禁止将甲基睾丸酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、苯甲酸雌二醇及其盐、酯制剂作为动物促生长剂使用。,兽药中经常使用的合成激素是类固醇药物。人工合成的类固醇激素具有内源性激素(雌二醇,睾丸激素,孕酮)相似的结构。欧盟因这类药物残留会影响健康而禁用。1982年,一批有雌激素活性的人工合成代谢制剂,即1,二苯乙烯类药物被禁止使用。除了激素类外,某些运动抑制剂和咔唑心安等肾上腺素阻断剂,也曾经被用作减少家畜、
14、家禽的运动量,达到减低机体能量物质消耗,增加能量积累的目的。如在长途运输或应激条件下使用利血平这类制剂可以避免家畜体力过分消耗,防止骚动和外伤,减低运输和应激损失。此外,使用此类制剂可以使产蛋鸡和肉鸡安全渡过高温季节,减低其能耗,从而达到催肥和增加产蛋率的作用。,另外,尚有一类人工合成的、具有同化作用的增强剂。如玉米赤霉醇(zeranol)等间羟基苯酸丙酯和克仑特罗等受体激动剂,它们可以使动物组织发生重新分布,特别是精瘦肉增加和脂肪减少,提高肉的品质去迎合消费者的喜好。然而,这些物质作为药物有明确的适应证,如果在动物源食品中残留就有可能对机体造成损害。,二、食物中兽药残留,(1)兽药残留食品动
15、物在应用兽药(包括药物添加剂)后,兽药的原形及其代谢物、与兽药有关的杂质等有可能蓄积或残存在动物的细胞、组织或器官内,或进入泌乳动物的乳、或产蛋家禽的蛋中,这就是残留,又称残留物或残毒。动物性食品中除了兽药残留外,还可能发生农药残留、意外污染物或环境污染物等其他化学物残留,本章的重点为兽药残留。兽药残留是指动物产品的任何食用部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。,(2)兽药残留的来源,在食品动物体内或动物性食品中发现的违章残留,大都是由用药错误造成的,其原因主要有:不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物
16、残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数;在休药期结束前屠宰动物;屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查; 以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;,药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物;饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料;接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水);任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。,美国食品药物管理局(FDA)和美国兽医中心(CVM)的调查结果表明,引起违章药物残留的常见原因为:不遵守休药期;使用未经批准的药物;未做用药记录;饲料加工或运送错误;盛放它种药物的贮存容器未充分清洗干净等
17、。,(3)兽药残留的种类(形式),第一类是以游离或结合形式存在的原药及其主要代谢物(除高亲脂性化合物外),因代谢和排泄迅速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能具有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化的中间产物(亲电子基团、自由基等),因而对消费者具有潜在的危害性。第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们的存在对于靶动物有潜在的毒性作用,而对于消费者,由于结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低的毒性。,残留毒理学意义较大的兽药按其用途分类主要包括:抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类药、生长促进剂和杀虫剂等。抗生素和抗菌素统称抗微生物药物,是最主要
18、的兽药添加剂和兽药残留,约占药物添加剂的60%。,(4)影响食品动物组织中药物残留的因素,经内服或注射给药的动物,其组织中存在的药物及其代谢物或降解产物的残留。组织中药物残留随药物种类、剂量、给药途径、药物及其代谢物特性的不同而异。在有些情况下,饲料也会影响动物组织中的药物残留,但药物休药期的执行情况是影响组织残留的最重要因素。屠宰后胴体加工过程也是影响药物残留检出率的因素之一。烹调和贮藏温度亦影响残留药物在组织中的稳定性。,对于大多数抗微生物药来说,药物从动物体内消除属一级动力学,而大多数组织中药物残留抗微生物活性的丧失是一个零级动力学过程。这表示药物残留量越多,它们从食用组织中消除所需的时
19、间就越长。如果药物添加剂是亲脂性的,那么它们会蓄积在脂肪组织中,而且其消除速度明显比亲水性药物慢。实际上,存在于家禽食用组织、牛肉、羊肉、乳和蛋中的药物残留的种类和发生率差异较大。这是动物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用药时间长短的一种反映。,三、兽药残留的危害,动物性食品中的兽药残留对人体健康的影响,主要表现为变态反应与过敏反应、细菌耐药性、致畸作用、致突变作用和致癌作用,以及激素(样)作用等多方面。(1)变态反应与过敏反应虽然许多抗菌药物被用作治疗药或饲料药物添加剂,但是只有少数抗菌药物能致敏易感的个体,如青霉素、磺胺类药、四环素及某些氨基糖苷类抗生素等。这些药物具抗原性,能刺激机体内抗体的形
20、成。由于青霉素具强抗原性,而且在人和动物中广泛应用,所以青霉素具有最大的潜在危害性。,变态反应症状多种多样,轻者表现为红疹,严重时甚至发生危及生命的综合征。抗菌药物残留所致的变态反应,在人所发生的食物耐受不良现象中所占的比例甚小,流行病学资料表明,在允许使用量的范围内,青霉素只对人群中的极少数个体产生危害作用。如某些人在食用了含有10、4.2、0.06和0.03I/mL青霉素的牛奶后,发生了广泛性瘙痒、红疹、头痛等过敏反应;食用了急宰前3天使用过青霉素的鲜猪内后(每克猪肉中含有0.45I的青霉素),病人出现广泛性红疹。经调查,病人在以前曾用过青霉素治疗。,四环素类药物（主要是金霉素和土霉素）引
21、起的变态反应比青霉素少的多。由四环素类药物引起的型变态反应（过敏或荨麻疹）已见报道，然而这种病例非常少见。最常见的四环素不良作用有皮肤损伤和光敏性皮炎,一般认为是变态反应。肉中的金霉素残留不能耐受烹调温度,在烧煮过程中转变为不具致敏作用的异金霉素。土霉素可能转变为-和-阿朴氧四环素。据报道,烹调温度能使金霉素和土霉素分解,因而认为肉中四环素类药物残留对消费者是安全的。,氨基糖苷类抗生素如链霉素、双氢链霉素、新霉素能与特定组织(如肾)中的成分紧密结合,因而需要30天以上的休药期才能使药物从组织中明显消除。此外,氨基糖苷类抗生素能耐受很高的烹调温度。因此,烹调不能成为一种避免变态反应发生的有效措施
22、。,人对磺胺药过敏反应表现形式不同,而且大多数与人的治疗用药有关。皮肤和黏膜上可出现磺胺药的过敏性损伤,一般真皮损伤的发生率为1.5%2.0%。在应用磺胺药治疗后,可观察到类似血清病样的症状（白细胞减少）；药物热通常是一种不良作用；磺胺药的其他不良作用尚有造血系统紊乱,包括急性溶血性贫血、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、血小板减少和嗜酸性细胞增多等。,(2)细菌对抗菌药物的耐药性,细菌耐药性是指有些细菌菌株对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌药物产生了耐受性。细菌耐药性是受染色体或质粒上的基因控制。染色体型耐药性是在抗菌药物存在或不存在的条件下,由某种细菌自发突变产生的,这种情况较少见,而且只
23、对某一特定的抗菌药物产生耐药性。大多数细菌的耐药性属质粒型耐药性,它由R-质粒控制。R-质粒是指细菌细胞染色体外的所有遗传因子,又称R-因子,即耐药因子。,细菌对抗菌药物产生的耐药性是人们关注的问题,研究表明,随着抗菌药物的不断应用,细菌中的耐药菌株数量也在不断地增加。动物在反复接触某一种抗菌药物的情况下,其体内的敏感菌受到选择性的抑制,从而使耐药菌株大量繁殖。在某些情况下,动物体内耐药菌株又可通过动物性食品传播给人,而给临床上感染性疾病的治疗造成困难。虽然一般可采用替代药品,但在寻找替代药品的过程中,耐药菌感染往往会延误正常的治疗过程,而且替代药品的毒性可能更高、价格更贵,或疗效更低。,兽医
24、临床上用作治疗药物的抗菌药物很多,饲料中也经常添加一些抗菌药物,以改善动物的生产性能。不论已知的抗生素,还是临床上尚未用作治疗药物的新抗菌药物,有些人都将其用作饲料药物添加剂。人们担心各种抗生素的应用会导致细菌对多种抗生素产生耐药现象,即多种耐药性,又称多抗性。由于进入食物链的各种多抗性细菌的转移,给人和动物带来了潜在的危害。1968年已有一些学者提出,只能将非治疗用药物用作饲料药物添加剂的建议。,超级细菌,美国、英国、法国、日本、前苏联和瑞士等国家生产了一些畜禽专用的抗生素等,采取这些措施的最终目的是为了避免产生多抗性菌株,或者至少使菌株保持对治疗药物的敏感性。,(3)特殊毒性作用,主要包括
25、:致畸作用、致突变作用、致癌作用和生殖毒性作用等。致畸物:在妊娠关键阶段对胚胎或胎儿产生毒性作用造成先天畸形的药物或化学药品。致突变作用又称诱变作用。诱变剂(致变物)是指损害细胞或机体遗传成分的化学物。许多致突变物亦具有致癌活性。例如,人工合成的化学物质多环烃,以及天然物如黄曲霉毒素及有关的化合物,既具有致突变作用,又具有致癌作用。,由于药物及环境中的化学药品可引起基因突变或染色体畸变而造成对人群的潜在危害,因此越来越引起人们的关注。如苯并咪唑类抗蠕虫药,通过抑制细胞活性,可杀灭蠕虫及其虫卵,故抗蠕虫作用范围广泛。然而,其抑制细胞活性的作用使其具有潜在的致突变性和致畸性。许多试验结果表明,此类
26、药物不仅对实验动物,而且对食品动物可诱发各种畸形,并肯定了畸胎生成的一般规律。以绵羊与牛,大鼠与兔子相比,每一种动物均有其特异的种属敏感性或耐受性。与成年动物的急性中毒剂量比较,相当低的剂量即可诱发畸胎生成。雌性动物妊娠的特定时期(胚胎细胞分化和胎儿组织形成期)对致畸物较敏感,也只有在胚胎发育的特定时期内,药物的致畸作用与其剂量相关。,(4)激素(样)作用,大约在30多年前,具性激素样活性的化合物已作为同化剂用于畜牧业生产,以促进动物生长,提高饲料转化率。由于用药动物的肿瘤发生率有上升的趋势,因而引起人们对食用组织中同化剂残留的关注。1979年在美国禁用己烯雌酚作为牛、羊以及鸡的促生长剂之后,
27、一些国家也相继禁止应用同化剂,尤其是雌激素同化剂。激素同化剂的法定埋植部位应该是屠宰时废弃的动物组织，如耳根部,因为美国等国家规定食品动物的耳朵在屠宰时应废弃,而深部肌内注射同化剂则属非法用药。,随着人民生活水平的提高,人们对动物性食品的消费量越来越多,也造成了一些现代病如肥胖儿、早熟儿等。儿童的早熟除与生活水平的提高(动物性食品摄入量较多)有关外,也不能不考虑在动物性食品中可能会存在各种来源的性激素;包括在食品中添加激素或不适当地较大剂量用于养殖业的人工合成同化性激素。,(5)一般毒性作用,以一般毒性作用较为严重的克仑特罗为例。瘦肉精-克仑特罗对体内物质代谢影响较大,可抑制脂肪生成,并促进其
28、分解；促进蛋白质的合成,减少其降解,从而加速肌肉生长；还能将体内合成脂肪的能量和物质用于增加蛋白质的合成。由于克仑特罗大量蓄积在动物肝脏内,并在血液中以高浓度存在,如果用克仑特罗作促生长剂的猪,在宰前没有休药期,那么人体在食入100g200g 肝脏或肺脏时,就摄入与治疗剂量相当的克仑特罗,则很快会引起心动过速、口干、冷汗、肌肉震颤和四肢无力等急性毒性作用。,四、兽药残留的现状与法规,兽药残留主要是由于不合理使用药物治疗动物疾病和作为饲料药物添加剂而引起的。1990年出口日本的1万吨肉鸡,由于检测出抗球虫药氯羟吡啶的残留量超标,要求我国政府销毁所有产品,给我国造成很大经济损失。出口到德国的蜂蜜由
29、于农药“杀虫脒”残留超标而被退货,接着欧共体、美国、日本也相继拒绝进口我国蜂蜜,使我国蜂蜜在世界市场上的销售发生严重因难。1998年4月,从内地出口到香港的生猪,其内脏食后导致17人中毒。其原因是内脏中含有违禁药“盐酸克仑特罗”。此外,我国出口的畜禽产品还多次出现安眠酮类、雌性激素、抗生素等药物残留超标而被取消出口的事件。,鳗鱼养殖和加工是20世纪90年代以来在我国沿海地区如广东、福建、广西等地区发展起来的具有高附加值的“三高”农业产业,其规模和技术含量在20世纪90年代中期得到迅速扩大和提高。我国的鳗鱼及其制品主要销往日本。日本曾对我国出口鳗鱼进行过调查,发现抗生素在中国鳗鱼养殖中普遍使用,
30、药物残留检出率相当高。如果有关方面不及时采取有效的控制措施,鳗鱼加工企业、养殖户、鳗鱼饲料加工企业可能将受到严重的冲击。,1995年、1996年,欧盟兽医委员会派员对我国进行了考察和评估,认为我国的兽医卫生状况达不到欧盟的要求,于是做出了从1996年8月1日起,禁止从我国进口禽肉的决定。1997年、1998年欧盟又派员来华考察,结果仍达不到其要求。目前,我国肉、蛋、奶的出口形势仍相当严峻。我国已开始重视动物性食品中的兽药残留问题,制订了各种兽药残留的法律和法规,修订了动物性食品中兽药残留最高限量标准,并开始建立了全国范围的兽药残留监控体系。,第六章 兽药残留检测技术,第二节 样品前处理,样品前
31、处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。样品前处理的目的是消除基质干扰、保护仪器、提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。不同样品前处理方法的选择，需要根据样品中危害残留物质的特点。残留分析中的样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便;屠宰场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本,如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。,食品样品前处理,食品样品前处理方法的选择取决于食品危害残留物质分析的特点：(1)基体复杂,主要有水分、糖类、脂肪、蛋白质等。样品范围宽,按状态分有固态和液态。固态有水果、蔬菜、
32、肉、鱼、蛋、家禽、调味品等碳水化合物食品。液态有饮料、乳制品等。(2)目标化合物检测限量越来越严格,如欧盟要求食品中氯霉素检测限量要求为0.1g/kg,己烯雌酚要求为0.05g/kg。,(3)某些残留危害物质在食品样品中存在的浓度极低,为了防止样品基体组分的信号掩蔽痕量被测物和污染仪器,必须将大多数基体组成复杂的样品进行前处理,通过前处理把被测物质从基体中分离出来,经过浓缩后再进行分析。(4)各目标化合物的性质如极性、沸点、热稳定性等差异极大。,(5)可能同时存在多组分,由于食品中危害残留物质以多组分并存,而且它对人类健康影响有协同效应,例如狄氏剂、DDT等农药与多氯联苯共存时,会使毒性增加一
33、倍。因此,各国十分注重食品中多组分危害残留物质现场调查,特别对进出口的农产品、食品进行严格捡验。食品分析中样品前处理,包括了抽样、制备和提纯。,一、生物样品的类型,兽药残留分析中,最常用的生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。(1)动物组织 肌肉(除去可见的脂肪)中水分约占75%,蛋白质(肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖类1.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类。肌浆蛋白(肌红蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白)溶于浓盐水,胶原蛋白和弹性蛋白(结缔组织)在上述溶剂中均不溶。,不同种类动物的食物构成和肌肉的
34、成分,如家禽和牛的肌红蛋白和脂肪含量存在差异,这些变化会影响分析方法的回收率或干扰检测,因此一种动物组织的残留分析方法对其他动物组织样品不一定适用。例如,用水提取鸡肉和牛肉组织中呋喃唑酮,回收率在75%以上;同样的方法提取猪肌肉样品,回收率仅为10%,改用25%乙腈提取时回收率明显提高,推测呋喃唑酮与猪肉中某种蛋白质结合较强。肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除缓慢,因此常被作为残留检测的靶组织。,(2)尿样,尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基,因而需立即冷藏或防腐处理。冷藏条件一般可置4 冰箱内。若欲在室温下保存,应在收集尿样后,立即加入防腐剂。常用的防腐剂有
35、甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性,以抑制细菌的繁殖。加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应,应由实验验证,以便选取合适的防腐措施。,在所有体液样品中,尿样最容易获得,并且样品量多,内含药物(母体药物及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。尿中药物大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,因此无论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态的药物水解,使药物游离出来。尿样pH变化范围大,分析前需调节到一致的pH值。,(3)血样,血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐渐凝固,上层析出澄清的黄色液体称为血清(serum)。分离血清时
36、,可将凝结后的血液置离心机中离心,将上层血清转入另外容器中保存,得到的血清,一般可占全血量的40%左右。,若采血后立即将血液转入有抗凝剂(常用肝素)的容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,12h沉降完全,上层的黄色液体称为血浆(plasma)。离心使上层血浆与下层血细胞充分分离,将血浆转移至另一容器内供分析。血液通过抗凝获得的血浆量,一般比血清稍多,接近全血量的50%。,若抗凝血不离心,保持血浆和血细胞混合在一起,则称为全血(whole blood)。全血样品可冷冻贮存或直接供分析。全血样品放置或自贮存处取出解冻之后,可明显分为上、下两层,上层为血浆,下层为血细胞,但轻微
37、摇动即可混匀。血浆和血清的化学成分与组织液相近,测定血浆或血清中药物浓度,比全血更能反映作用部位药浓的变化,测定方法一般也可互相通用。因为从抗凝血制备血浆的速度较快,并且分离出的血浆量比血清多,所以应用血浆比较方便;若血浆中含有抗凝剂对测定有影响,则应使用血清样品。,通常药物在血浆中均与血浆蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)发生一定程度的结合,一些药物甚至蛋白结合率可达90%以上。因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。,(4)奶样,牛奶的含水量约87%,蛋白质(以酪蛋白为主)为3.3%,脂肪(甘油三酯)为3.7%,糖类(乳糖)为4.7%,以及一些无机盐、维生素和酶类(过氧化物酶、脂肪
38、酶等)。奶是一种复杂的非均相体系。乳脂球的主要成分为乳脂,表面包以由酪蛋白、类脂、酶、无机盐和水分构成膜,使乳球能稳定地悬浮在奶中并保护内部的乳脂免遭脂肪酶的水解,当剧烈振荡时球膜被破坏,脂肪球即相互黏合析出。奶中还含有大量由酪蛋白或脂蛋白构成的胶束体系,当酸化或加热时,胶束结构解体,蛋白质沉淀析出。,非解离性的或极性较低的药物易由血浆向奶中扩散,导致奶中残留。与血浆样品类似,奶中的药物可与蛋白质结合。因此在萃取之前,必须将结合态的药物游离出来。,(5)蛋,禽蛋包括蛋黄和蛋清。蛋黄的含水量约50%、蛋白质16.5%、脂肪33%、糖类0.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶
39、、肽酶和过氧化氢酶)蛋清含水量达88%,蛋白质10.5%和极少量的碳水化合物和脂肪。与蛋清相比较,蛋黄基本上为疏水性环境,低极性药物的残留较多。,如果需要分别测定蛋黄和蛋清中的残留,最好将刚产出后的蛋分离蛋黄和蛋清,避免药物由蛋黄向蛋清扩散。与尿液类似,蛋成分的pH变化范围大,分析前需调节pH值。,二、样品制备和贮存,样品的制备方法，依据法规要求的不同和食品本身特性的差异而不同。有的要以全样计,有的以脂肪计。一般来说是取可食部分制备样品(除非有其他要求)。如对于肉类有的国家法枧规定要以脂肪计算食品安全危害物的量,有的要求以全样来计算。对于原料性的食品, 如蔬菜、水果应除去明显腐烂的叶、浆果等;
40、有皮和核的水果还应除去皮和核,坚果要去壳;玉米应除掉玉米壳和穗轴,蛋要去壳;鱼要去头、尾、翅、鳞、内脏和非食用的鱼骨。对于加工食品,一般按照原样制备实验室样品(如浓缩产品、脱水食品)。,为保证取样的准确性、减少污染和便于保存,对组织样品宜分取一个完整解剖部分,如一个肝叶或一侧完整的肾,小动物应摘取完整的脏器,并立即密封。样品被绞碎或匀浆后进行缩分。生物样品采样后除立即分析外,都需要在适当条件下保存,目的是避免被测组分发生分解或产生其他化学变化。,贮存,冷冻保存是最常用的方法,一般冷冻温度为-20,此时生物样品如血浆、尿液和组织样品均被冻凝,可以终止样品中酶的活性,又可以贮存样品。在某些情况下若
41、收集的样品来不及冷冻处理,可先将其置冰屑中,然后再行冷冻贮存,临用前再融化并放至室温后供测定。目前发现,即使在-20 时,围绕某些生物大分子(如糖蛋白)周围的水分子仍具有足够的势能可保持其流动性。将影响药物的稳定性。,对于一些易代谢的药物,如磺胺类、聚醚类、同化激素,它们的肝和肾脏样品不宜长期存放,理想的冷冻温度应为-40-80 。为防止含酶样品中被测组分进一步代谢,采样后必须立即终止酶的活性。常采用的方法有:液氮中快速冷冻、微波照射、匀浆及沉淀、加入酶活性阻断剂(通常加入氟化钠)等。某些生物样品中的药物易被空气氧化,如儿茶酚类中的阿朴吗啡,具有邻苯二酚结构,易被空气氧化产生醌类杂质,若收集的
42、血浆样品不加抗氧剂直接在-15 冷藏,仅能稳定4周;但加入抗坏血酸后,则可稳定10周。,冷冻时,若使用玻璃容器贮存样品,需注意防止温度骤降使容器破裂,造成样品损失或污染。而塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物还会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此,必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。,三、样品均匀化,对于血浆、奶、尿液样品,可置涡旋混合器上混匀,以免造成测定误差。对于肌肉、组织、粪便等半固体样品都存在均匀化这一问题。其中肌肉和组织样品可置匀浆机中均质,粪便样品可加入少量甲醇或其他液体搅匀。同时还应注意取
43、样的代表性问题。,四、去蛋白处理,生物样品如肝脏、肾脏、血浆等含有大量的蛋白质,它们能结合药物,因此对于某些药物的测定,必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。为什么要除去蛋白？因为生物样品含有大量的蛋白质,蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件,如直接进样用液相色谱分析含蛋白质的体液样品时,蛋白质会沉积在色谱柱上,这不仅影响柱效,而且大大缩短色谱柱的使用寿命。目前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各种方法之前应了解该方法是否会导致生物样品中的药物发生分解或影响药物的提取等。,注意方法选择,通常去蛋白过程是将蛋白质变性处理后,把与蛋白结
44、合的药物解离出来,离心分离以除去蛋白。通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂,使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐),有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),离心后取上清液用于分析。,1、有机溶剂沉淀,甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂,尤以甲醇和乙腈为最常用。甲醇与蛋白形成絮状沉淀易于离心分离,得到澄清的上清液;乙腈与蛋白形成致密沉淀,易离心除去,沉淀效率较甲醇高。使用时应加入足量的沉淀剂,通常加入量为样品体积的1.52倍。,2、酸性沉淀,常用的酸性沉淀剂有三氯醋酸和高氯酸,其他还有钨酸、钼酸、磷钨酸、磷钼酸和苦味酸等
45、。酸性沉淀剂能同蛋白质的阳离子形成不溶盐而沉淀,必要条件是溶液的pH要低于蛋白的等电点。加入沉淀剂之后立即形成白色沉淀(必要时可加热使沉淀完全),离心后可得到澄明的上清液。,三氯醋酸(常用10%溶液)沉淀蛋白的作用很强,因此最常使用,但应注意试剂中含有的杂质,将它们引入离心后的上清液中,可能会干扰药物的分析。其次应注意,当上清液再用乙醚等有机溶剂萃取时,三氯醋酸则连同溶入其内的杂质会进入有机相,也可能干扰药物的分析。采用高氯酸作为蛋白沉淀剂时,其优点是残留在上清液中的ClO4-可加入钾盐除去。,3、无机盐沉淀,一些无机盐如硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等,能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷,使蛋白质失去胶
46、体性质而沉淀下来。无机盐中以硫酸铵最常用。常用的重金属盐类有汞盐、铜盐和锌盐等,它们能与蛋白质形成不溶盐而沉淀析出。如可用HgCl2作为蛋白沉淀剂处理血浆样品,离心后用比色法测定上清液中的水杨酸浓度。采用蛋白沉淀剂,只要加入足量,一般可除去98%以上的蛋白。蛋白沉淀后是否与之相结合的药物能游离释出,目前尚缺乏系统的研究资料,仅观察到少数现象。,4、透析法,透析法与超滤法也是除去样品中蛋白的方法。透析法很费时,溶质透过膜的程度与被测物的性质、温度有关,膜需常常更新,很难自动化,因此透析法一般不用于常规分析,而用于药物在生物样品中蛋白结合率的研究。,5、超滤法,超滤法是另一种除去样品中蛋白和其他大
47、分子的方法,也是一种薄膜分离技术。与蛋白沉淀法相比,其优点是适用于小量样品,不稀释试样,也不改变试样的pH,尤其适于含对酸碱不稳定的化合物的样品,用于样品的浓缩、脱盐、不同分子尺寸的分离。如果待测物易被某种酶分解,那么超滤除去该酶后就避免了待测物的分解。在残留分析中超滤法常用于牛奶、血液中游离药物浓度和药物-血浆蛋白结合率的测定。超滤法的缺点是待测物可能被结合在滤膜上而影响回收率,而且一些能与大分子蛋白结合的药物也会随着蛋白质被除去而丢失。,五、冷冻干燥,冷冻干燥是贮存和预处理某些生物样品的有效方法,适合于处理量大的样品。例如,一些样品中所含药物水溶性很强(不容易被有机溶剂萃取),可冻干后再进
48、行液-固萃取。冻干法也适用于一些含挥发性药物的样品以及对热不稳定的样品。此外,还有一些生物样品中的药物需进行衍生化,若采用常规的液-液萃取,在一定温度下挥发去有机溶剂后再进行衍生化,则在加热过程中会导致药物分解或随溶剂一起挥发,因此也宜将这些样品经冻干处理后再行衍生化。,生物样品冻干时,可先将其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其他低温条件下,半固体样品如粪便、组织等冷冻时间约110min。冷冻后水分在样品表面形成“冰壳”,增加了挥发面积,再将其放入冻干机内减压,冰则直接升华,和其他挥发性杂质一起被除去,使样品干燥。冻干后的样品通常可直接加入有机溶剂萃取。冻干时应注意某些挥发性强的药物可能挥发损失。,
49、操作步骤,六、结合物水解,以结合状态存在的药物大多存在于尿中,但也存在于肝脏和血液中。常用的结合物水解的方法有:(1)酸水解酸水解通常使用无机酸,如尿样中结合物水解可加入适量的盐酸液。加入盐酸的浓度、酸化时间以及是否需要加热等,随药物而异,但最终应通过实验确定。水解后的样品呈强酸性,必要时可用碱液调整pH后再进行萃取。,药物在体内经代谢反应之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等结合物,(2)酶水解,酶水解是专一性很强的水解结合物的方法。通常使用的水解酶是-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专门水解药物的葡萄糖醛酸苷,后者水解药物的硫酸酯。也可用两者的混合物,将生物样品中药物的葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同时水解。
50、尿液中通常存在以上两种结合物,因此混合酶水解法具有实用价值。,目前已有葡糖苷酸/硫酸酯混合酶可供使用,应用时必须按不同酶试剂的要求,控制一定的pH(一般pH4.57.0),于样品中加入酶之后,厌氧温育16h左右。若要分别测定药物的葡萄糖醛酸苷和硫酸酯,则应分别使用对应的葡糖苷酸酶及芳基硫酸酯酶来进行水解。优点：与酸水解相比,酶水解反应比较温和,一般不会引起被测药物分解；缺点：酶试剂较贵、水解所需时间较长,使实验费用增加,此外酶试剂还会带入黏液蛋白等杂质,可能导致样品乳化或造成色谱柱阻塞。,(3)溶剂解,某些药物或内源化合物的硫酸酯,可随加入的萃取溶剂,在萃取过程中发生分解,通常称为溶剂解。溶剂
