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1、第六章 兽药残留检测技术,第八节 激素类药物残留的危害分析与检测方法,一、概述,兽用激素包括皮质激素、同化激素。天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松。这类皮质激素有较强的糖代谢及抗炎等作用,而对水、盐代谢的作用较弱,所以称其为糖皮质激素。临床上应用广泛。通常所说的皮质激素即指这类激素。近年来,为了提高疗效,降低副作用,而合成了一系列的糖皮质激素衍生物。如泼尼松(强的松)与氢化泼尼松(强的松龙),糖原异生作用更强,对水盐平衡的影响更弱。较小剂量常用于补充肾上腺皮质功能缺乏,较大剂量则能抑制免疫过程中的多个环节，缓解炎症。,1、糖皮质激素,糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激的反应性
2、,具体表现在抗炎、免疫抑制、抗毒素和抗休克等方面。还可使血糖升高,蛋白质分解加强,使血淋巴细胞、嗜酸性细胞减少,红细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等。糖皮质激素主要用于以下疾病:各种炎症、严重感染及传染病、过敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产。皮质激素会引起水分在体内滞留,增加肉的重量,因而在畜牧业中有可能当作增重剂而被滥用。滥用这类药物后,肉品感官上多汁、肉瘦。因此饲养场中用皮质激素作催长剂，属于违禁使用。,泼尼松,别名强的松,不溶于水,微溶于乙醇。应避光、密封保存。具有抗炎及抗过敏作用,还能促进蛋白质分解转变为糖,减少葡萄糖的利用,因而使血糖及肝糖原增加,尿中可出现糖尿,同时增加胃液分
3、泌,促进食欲。其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小,抗炎及抗过敏作用较强,副作用较小,故比较常用。主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、风湿、类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上腺皮质功能不足症、湿疹等。,地塞米松,别名氟美松,不溶于水,溶于无水乙醇。应遮光保存。抗炎及控制皮肤过敏的作用比泼尼松龙更显著,而对水、钠潴留和促进钾排泄作用较弱。目前地塞米松的应用愈来愈广泛,有取代泼尼松等其他合成皮质激素的趋势。肌注后吸收快,狗和鼠分别于0.5h和6h达血药峰浓度。大部分在肝内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而灭活。,氟轻松,氟轻松为白色结晶性粉末,无臭,不溶于水,溶于乙醇。应
4、遮光、密封保存。氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一种,涂敷于局部对皮肤、黏膜的炎症(搔痒及皮肤过敏反应等有效。不但疗效高,而且显效快,使用很低浓度即有明显作用,止痒作用尤其突出。本品主要用于各种皮肤病,如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等。对局部化脓创面,需同时配合新霉素等抗生素。,倍他米松,倍他米松为白色结晶性粉末,无臭,味苦,几乎不溶于水,溶于乙醇。本品含有多种盐类,如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等。均应遮光保存。内服吸收良好,生物利用度约为72%,血浆蛋白结合率64%,半衰期5.6h,4.8%的药量自尿液排出。牛肌注80g/kg,停药二日,肝脏中母药残留量为5.47.8g/kg;停
5、药八日,肝脏中母药残留量为10.9g/kg,肾脏、肌肉和脂肪中母药残留量分别为2.3g/kg、3.9g/kg和4.4g/kg。,2、同化激素,例如：雄激素能明显地促进蛋白质合成(同化作用),能使肌肉发达,体重增加;同时氨基酸分解减少(异化作用),使尿素生成减少降低氮质血症。但使用雄激素常可出现男性化现象,因而限制了它的应用。近年来人工合成的一些衍生物,其雄激素作用大为减弱,而同化作用则保留或增强,这些衍生物称同化激素。同化激素主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和损失过多等情况。畜牧业中使用同化激素(非治疗用途，提高胴体品质、增重和提高饲料转化率),可以很快产生显著和直接的经济效益,因此对生
6、产者有很大的吸引力。,同化激素类药物,去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮、氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮、诺甲醋孕酮、去甲睾酮、司坦唑醇、醋酸群勃龙等,醋酸甲羟孕酮,作用与黄体酮相似,孕激素活性强,无雌激素和雄激素活性,有抗雌激素作用。内服、注射均有效。内服在胃肠道吸收,在肝内降解。肌内注射后23天血药浓度达到峰值。血药峰值越高,药物清除越快。肌注150mg后69个月血中才检不出药物。小牛肌注复方制剂(24mg醋酸甲羟孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睾酮)后停药2天,血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为1g/kg,14天时降至30pg/kg。尿液在数天内都能检出
7、,14天时醋酸甲羟孕酮浓度为37pg/kg。肾组织残留相对较高,故作为残留检测的靶组织。,醋酸美仑孕酮,别名醋酸甲烯雌醇,为合成的避孕药。内服时孕激素作用约为黄体酮的75倍,无雌激素和雄激素活性,具有显著排卵抑制作用。小母牛用药后,母药和代谢物主要由粪便排出。停药6h,肝、脂肪、肾和肌肉组织中的残留量分别为915g/kg、78g/kg、1.21.8g/kg和0.51g/kg。脂肪、肝、肾和肌肉中母药残留量分别占总残留的80%、37%、30%和45%。美国FDA规定休药期48h,但欧盟禁止使用。,去甲睾酮,牛注射去甲睾酮后,脂肪中残留能被检出,并持续73天;尿中残留低于1g/kg。内服后脂肪中残
8、留未被检出,但尿中残留可检出。,醋酸甲地孕酮,本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用,但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱。不具有雌激素和雄激素样活性,但有明显抗雌激素作用。与雌激素合用,抑制排卵。动物致畸试验表明对家兔具有死胎率增加和致畸作用。口服后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短,大部分代谢产物以葡萄糖醛酸酯形式排出。,3、危害,对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素(包括雌酮、雌二醇、睾酮、皮质酮等物质)及2-受体激动剂(苯乙胺类)。这些存在于环境介质中的激素量虽然很小,但大多具有生物富集作用,容易通过食物链在人体中富集,对人类及其他生物产生极其严重的危害。主要产生各种慢性、蓄积性毒性,
9、如致癌、致畸、致突变等三致性毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等。2-受体激动剂类药物可产生急性毒性作用。危害多具有隐蔽性,易造成实质性危害而难以逆转。,糖皮质激素的危害,对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能,使肾上腺皮质萎缩。另外,过多摄入,可使人产生多毛症、满月脸以及免疫力下降等毒副作用。对敏感型的个体可造成血管扩张,血压降低而引起休克,甚至死亡。,同化激素的危害,目前,同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注。长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会导致机体代谢紊乱、发育异常,且多数激素类物质具有潜在的致癌作用。欧盟(原欧洲经济共同体)从1988年起,禁止所有同化激素用于动物的促
10、生长目的,并制定了严格的监测措施。我国从20世纪90年代起,也陆续开始对用于促生长目的的同化激素禁止使用,并已开展了相关的监测工作。但是,在利益驱动下,在世界范围内,同化激素仍在被大量滥用。就残留的危害和引起的争议而言,同化激素与抗生素并列为最重要的兽药残留。,雄性激素及其同化激素的危害,进人人体和动物体后,对其生殖功能产生严重的影响,甚至可能造成某些物种的绝种。通过食物链进行富集,在人体首先引起内分泌失调,危害生殖系统,易出现生殖器病变。对男性的危害：表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝肾功能障碍或肝脏肿瘤。对女性的危害：可引起女性的不孕、早产、流产、月经不调或女性男性化(肌肉增生、毛发增多)
11、等现象。目前,在局部地区已开始出现人类生存危机现象,如发达国家约有20%的家庭没有子女,而睾丸癌的患者明显增加。,对其他动物的危害,激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著,如鱼、鸟和哺乳动物的大量死亡,雌雄异变,生育和发育紊乱,免疫力下降等现象,可能均与此有关。1980年左右,美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼雄性化,且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾,原来正常雄性鱼出现超雄化,并表现为攻击性交尾行动。在日本,发现有雌海螺长有雄海螺的生殖器。,雌性激素的危害,雌性激素造成的环境污染,同样可能造成某些物种的绝种。通过食物链产生的富集作用,可引起人体的内分泌失调,对男性的危害：使男性精子数量
12、下降或出现女性化、性早熟、抑制骨骼发育等。对女性的危害：可引起女性 性早熟、生殖器官畸形和癌变,这一效应在其女性后代中表现更显著。对人类后代的危害：这些激素透过胎盘,可引起用药者子宫内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子发育不良、生殖器畸形。,对其他动物的危害,雌性激素的污染对人类之外的其他动物,同样有着严重的影响。美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出现卵巢异常、南极企鹅产下无精卵以及其他一些连体、畸形动物的较高比例出现,可能均与环境激素污染有关。,二、样品处理,（一）皮质激素的样品处理（二）同化激素的样品处理,（一）皮质激素,1、皮质激素样品预处理液体样品(奶、血液、尿
13、液)提取前需要脱脂肪,通常在4、7000g离心,除去浮在上层的脂肪。组织样品(肌肉、肝、肾)先要用切碎机或匀浆器进行组织破碎。水或醋酸盐缓冲液常用于样品的稀释。肝脏或尿样中的皮质激素结合物较多,因此先用葡糖苷酸酶/硫酸酯酶水解。由于酶解反应较慢,为保证水解完全,可在较高的温度下来加速水解或延长孵育时间。用超临界萃取法提取时,先要将组织样品匀浆,再进行冷冻干燥。,2、提取皮质激素,在一定的pH值条件下,一般用有机溶剂对样品提取和除蛋白。例如,氯仿提取牛奶中的氢化可的松;二氯甲烷-正己烷(4+1)提取牛奶中游离的氢化可的松和21-醋酸酯;乙酸乙酯提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙
14、、倍他米松,牛奶中的甲基强的松龙，牛奶中的氢化波尼松和地塞米松;含0.1mol/L氢氧化钠的乙酸乙酯提取牛组织中的地塞米松;,有机溶剂法提取,甲醇提取牛肉组织中的5种皮质激素;乙腈提取牛肝脏中的5种人工合成的皮质激素和牛组织中的地塞米松;乙醚提取牛粪中9种合成的皮质激素;二氯甲烷提取动物脂肪中的氟强的松龙;丙酮提取动物肝脏(肾脏和肌肉中的氟强的松龙。此外,牛奶和尿样可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提取。,3、净化,粗提取液中含大量的内源性干扰物质,为了消除或降低干扰并浓缩分析物,样液需要净化处理。净化方法包括液-液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及柱切换技术等。液-液萃取可以简单的一次溶剂萃取,也
15、可以多次溶剂萃取。萃取次数的多少,很大程度上取决于色谱的分离效率和选择性。色谱的分离度和选择性愈高,样品的提取和净化步骤可以简略一些,还可以提高分析效率。,液-液萃取法,液-液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质。例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松的乙酸乙酯提取液,依次用稀酸溶液和稀碱溶液洗涤,可以除去碱性和酸性的水溶性杂质。地塞米松的乙酸乙酯提取液,可以用氢氧化钠溶液洗涤,以除去酚类雌激素。甲基强的松龙的初提液蒸发至干后,用乙腈溶解,加入正已烷提取,正已烷提取液再用饱和的硫酸钠水溶液提取,最后用二氯甲烷提取。,氟强的松龙提取液蒸发至干后,依次用乙腈和正己烷,正己烷和水进
16、行液-液萃取,最后用二氯甲烷提取。通过液-液萃取对分析物的提纯,可以降低仪器检测的背景干扰,大大提高分析方法的检测灵敏度。皮质激素的初提液还可通过三相液-液分配净化：当组织样用乙腈水溶液初提后,上清液加入正己烷和二氯甲烷,进行乙腈、正己烷和二氯甲烷的三相液-液萃取,非极性组分被分配到正己烷相中,极性和离子化组分被分配到底层水相中,皮质激素和其他中等极性组分则分配到中间乙腈相中。,固相萃取法,采用有机溶剂萃取法容易出现乳化现象,因而常常导致提取回收率偏低或不稳定。固相萃取法克服了这一缺点,且具有操作简便、快速的优点。常用的固相萃取柱吸附剂有C18、C8和弗洛里硅藻土(Florisil)等。例如,
17、C18固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质激素净化,血浆或血清样品中氢化可的松净化。Florisil柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的松龙净化。,免疫亲和柱色谱法,免疫亲和柱具有高的专一性,近年来发展迅速,已应用于皮质激素的生物样品制备。例如,用两种抗体结合的免疫亲和柱,可以分离纯化肝、牛奶、尿样和粪样中9种皮质激素。免疫亲和色谱与GC-负离子化学电离质谱联用,已用于马组织中双氟美松的确证分析。,柱切换技术,柱切换技术自动化程度高,在线浓缩和纯化,大大简化了样品的前处理步骤。例如,牛组织中地塞米松测定时,样液经苯基柱初级分离后流至硅胶预富集柱中,通过柱切换,改变流动相将富集柱中的待
18、测物洗脱至氰丙基分析柱中分离。,超临界CO2流体萃取法,超临界CO2流体萃取法具有低温、快速、无溶剂萃取的优点。例如,超临界流体萃取法与HPLC联用,用于牛组织中地塞米松残留的测定。,（二）同化激素的样品处理,1、样品预处理：液体样品(尿、血浆、胆汁、牛奶)在提取前,可用水或磷酸盐缓冲液稀释。半固体样品(肌肉、肝、肾)在提取前需要均质。脂肪样可在4060 下加热,使脂肪融化成液体。,2、提取,生物样品中游离的类固醇激素可以用丙酮、乙醚、乙腈、碱性乙腈、四氢呋喃、叔丁基甲醚和氯仿-甲醇等有机溶剂提取。激素结合物的水溶性较大,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离激素。常用的水解方法有酶水
19、解和碱水解两种。酶水解通常使用葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡糖苷酸结合物,后者可水解硫酸酯结合物。,由于尿样和组织中通常同时存在上述两种结合物,常使用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶,控制pH4.57.0,于37 温育过夜。碱水解通常使用氢氧化钠溶液,由于合成类固醇常以酯制剂注入动物,水解后使酯类释放出游离的类固醇。,3、净化,粗提取液的净化方法包括液-液萃取、固相萃取法、液相色谱、免疫亲和色谱和超临界流体色谱等。为了达到更好的纯化效果,可将几种方法结合应用。,液-液萃取法,液-液萃取大多是去除水溶性提取液中的脂肪,例如,乙腈或甲醇提取液中加入正己烷或异辛烷,可脱去脂类物质。脂肪样中
20、的激素(30种雄激素)可用正己烷提取,再用甲醇-醋酸盐缓冲液(pH5.2)提取正己烷中的激素,同时去除脂类物质,水性提取液再用二氯甲烷抽提。当乙腈粗提取液调节pH至13时,加入正己烷和二氯甲烷进行三相液-液萃取,极性和离子型酸性物质进入水相,脂类等低极性物质则进入上层正己烷相中,而中等极性物质(如待测物：群勃龙和表群勃龙、去甲睾酮和美仑孕酮)进入中间乙腈相中。,固相萃取法,柱层析采用氧化铝、硅胶和Celite吸附剂,可有效分离分析物和内源性杂质,已应用于肉样中七种类固醇的纯化。固相萃取法具有简便、快速、经济等优点,已广泛应用于激素类药物的净化。正相柱常用硅胶、氧化铝、氰基型和氨基型吸附剂,反相
21、柱常用C18和C8吸附剂。C18固相萃取柱和Amberlite XAD-2离子交换柱适合纯化亲脂性或中性的同化激素。,司坦唑醇在C18固相萃取柱上的回收率偏低,是由于它的结构为吡唑环和雄(甾)烷环缩合而成,两个活泼氢可解离,具有离子化的性质,可与固定相或玻璃的活性点发生吸附,但其在C8和苯磺酸型的混合固定相小柱中,净化效果和回收率均佳。C18和硅胶的混合柱同样被用来对粗提取液的纯化。C8、硅胶和氨基型的混合固定相小柱被成功地应用于肉中同化激素和异化激素的分离,激素按照极性、非极性和酚类性质分段流出,然后再分别纯化。,固相萃取柱的净化效果有时并不能满足质谱检测的要求,因此有人将固相萃取法与色谱法
22、相结合,对样品提取液作更高的纯化。另外,还有采用C18柱对样液色谱分离,用自动馏分收集器收集分析物的馏分,馏分收集后吹干,然后衍生化GC分析。,柱切换技术,柱切换技术也被应用于激素的生物样品制备。例如,将牛肝提取液注入凝胶柱中,含同化激素的两段馏分被切入到硅胶柱(富集柱)中,群勃龙和去甲睾酮激素在富集柱中被浓缩纯化,洗脱后流入氰基柱中,再通过柱切换,流入硅胶分析柱中分离测定。,醋酸美仑孕酮为中性、脂溶性的类固醇,固相萃取法对牛组织提取液中醋酸美仑孕酮的提取纯化效果欠佳,故采用柱切换。其过程为粗提取液注入苯基柱中作初级分离,含分析物的馏分被切换到硅胶预富集柱中,浓缩提纯后再通过柱切换洗脱至硅胶分
23、析柱中分离测定;若收集馏分,可用于GC-MS分析。,免疫亲和柱色谱法,免疫亲和柱具有专一性高的优点,但适合同化激素纯化的免疫亲和柱目前还不多。对于多残留分析,可将几种免疫亲和固定相配伍使用。免疫亲和柱已应用于生物样品中己烯雄酚、双烯雌酚和己烷雌酚的纯化,以及肉和尿中去甲睾酮、睾酮和群勃龙的纯化。此外,亦有报道采用在线免疫亲和色谱法,对生物样品中的去甲睾酮及其表代谢物进行纯化。,超临界流体色谱法,超临界流体萃取可以在低温条件下获得无溶剂的提取物,且快速,但从生物样品中分离激素的研究目前还很少。有报道采用超临界流体萃取和超临界流体色谱相结合,用来检测猪肾中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚残留。超临界
24、CO2提取时,同化激素被柱子保留,而非极性的内源性物质不被保留,然后换流动相来洗脱激素,串联质谱检测。,用超临界CO2提取牛组织中7种促生长激素,发现极性药物(地塞米松、曲安奈德、玉米赤霉醇)的回收率偏低,约44%58%,非极性药物(醋酸美仑孕酮、甲羟孕酮、己烯雌酚)的回收率相当高,约83%91%。由于共萃取物的干扰,群勃龙不能被检测到,尤其是脂肪和肝脏样品中的共萃取物,对群勃龙的色谱峰有严重干扰。因此,超临界流体萃取法并不能取代所有的样品处理方法。在超临界流体萃取前后,还需要其他净化方法加以处理。,三、分析方法,（一）皮质激素分析方法有关动物性食品中皮质激素类的残留分析,文献报道很少。皮质激
25、素类的残留分析主要采用色谱法,包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法。,1、薄层色谱法,薄层色谱法具有设备简单、经济等优点,适合生物样品的筛选分析。早期采用苯肼硫酸溶液作显色剂,后来采用其他一些显色剂,如磷酸甲醇溶液、四唑蓝、对甲苯磺酸和2,3,5-三苯基-2H-四唑氯。Vanoosthyze等建立了一种高效薄层色谱法,能够检测注射部位中的29种皮质激素。样液滴注于Kieselgel 60板上,以氯仿-甲醇作展开剂,展开后组分得到很好地分离,用2,4-二羟苯甲醛喷雾显色,色泽差异明显,366nm处荧光检测分析物。,2、气相色谱法,GC法分析动物源性食品中皮质激素,早期采用TMS衍生化,OV-1
26、7 275cm柱分离,电子捕获检测器检测。例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松TMS衍生化,采用N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺、三甲基甲硅烷咪唑和三甲基氯硅烷混合衍生剂进行硅烷化。目前,GC-MS得到了广泛应用。测定地塞米松时,用TMS-enol-TMS衍生化较好。,例子：,Delahat等报道了一种GC-MS法分析肝脏、牛奶、尿样和粪样中的5种皮质激素(氢化波尼松、甲基强的松龙、地塞米松,双氟美松和异氟烷)。不同样品的提取肝脏样品：取5g肝样加10mL醋酸盐缓冲液均质,加入Helix pomatia混合酶,于60 孵育2h,水解结束后,用20mL乙腈提取,离心,取出上清液
27、并加入8mL正己烷和2mL二氯甲烷混合,离心,取出中间乙腈相层并蒸发至干,残余物用1mL乙醇溶解,过C18固相萃取柱。,不同样品的提取,牛奶样品：取10mL牛奶,于4 离心,除去浮在上面的脂肪并将剩下的脱脂奶用等量的水稀释,过C18固相萃取柱。尿样：取5mL尿样,加入2mL pH4.8醋酸盐缓冲液和Helix pomatia混合酶,于37孵育过夜,水解结束后,加入5mL磷酸缓冲盐,过C18固相萃取柱。粪样：取5g粪样,加入10mL醋酸盐缓冲液和35mL乙醚,振摇,离心后取出乙醚相并蒸发至干,残余物用3mL乙醇溶解,加入12mL水和5mL正己烷,振摇,静止分层后取出水相,过C18固相萃取柱。,不
28、同提取样品的净化,牛奶、尿和粪便样液过C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)、5mL二氯甲烷-正己烷(20+80)和5mL乙酸乙酯-正己烷(10+90)淋洗,用3mL乙酸乙酯洗脱皮质激素,洗脱液蒸发至干后,用0.5mL乙醇和5ml磷酸缓冲盐溶液溶解残余物,过免疫亲和柱净化。,肝脏样液过C18固相萃取柱后,依次用5mL水、5mL丙酮-水(20+80)、5mL甲醇-水(20+80)和5mL正已烷淋洗,用1mL乙酸乙酯洗脱。经过固相萃取柱净化后,将洗脱液的pH值调至77.5,再过免疫亲和柱(含地塞米松和氢化波尼松抗体的凝胶)纯化,用水淋洗柱子,
29、3mL甲醇-水(80+20)洗脱。取部分洗脱液,加入氯铬酸吡啶氧化,氧化的皮质激素衍生物进行GC-MS分析。Courtheyn等对氯铬酸吡啶氧化法作了改进,简化了样品前处理步骤,采用负离子化学电离GC-MS法测定尿液和粪便中地塞米松含量,以二氟美松作内标,测定结果与酶联免疫法一致,该方法检测限0.1g/L。,3、液相色谱法,反相液相色谱（RP-HPLC）和正相液相色谱（NP-HPLC）均可用于皮质激素的分析。由于皮质激素有较强的紫外吸收,因此紫外检测法常被广泛采用,检测波长一般设在254nm。但对于动物源食品中残留的某些皮质激素及其代谢物,则必须制备成衍生物后,进行荧光检测。HPLC-MS技术
30、在皮质激素分析中也有应用,例如,LC-APCI-MS对牛组织中地塞米松的鉴别测定。,Goto等报道了NP-HPLC法同时分离测定血清中的地塞米松和氢化可的松。这种方法包括用9-蒽腈进行柱前荧光衍生化,衍生物经固相萃取柱净化,以除去过量的衍生剂及内源性的类固醇杂质,色谱分离后用荧光检测。Prasad等采用NP-HPLC法同时测定血浆中氢化可的松、可的松、地塞米松、强的松、氢化波尼松和甲基强的松龙残留,最低检测限为10g/L。Santos-Montes采用RP-HPLC测定尿中的皮质醇和可的松。Schild采用RP-HPLC测定血浆中的地塞米松。,Fluri等研究了电喷雾电离LC-MS测定人尿中9
31、种糖皮质激素的方法。崔晓亮等采用超高效液相色谱-串联电喷雾四极杆质谱法同时测走牛奶中12种糖皮质激素的残留。Van de Hauwe等报道了电喷雾电离LC-MS/MS法测定牛组织中地塞米松和二氟美松残留量。Sangiorgi等采用大气压化学电离LC-MS/MS测定牛尿中7种糖皮质激素。Van de Hauwe等报道了采用电喷雾电离LC-MS/MS分析牛肝中11种糖皮质激素。,（二）同化激素分析方法,生物样品中同化激素类的分析主要采用色谱法,包括薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。,1、薄层色谱法,薄层色谱法具有快速、经济等优点,适合残留分析的初筛。例如,用于雌激素的多残留筛选。为了提高薄层色谱
32、分析的灵敏度和选择性,在显色剂研究上做了大量的工作,一些与雌酮、雌二醇、己烯雌酚、玉米赤霉醇和玉米赤霉烯醇发生显色反应的染料被相继报道。重氮基染料与雌激素反应,形成重氮基衍生物、酚基和二羟基苯甲酸内酯类的雌激素衍生物,它们的色泽强度各不相同。此外,科林斯红和快蓝BB与激素反应成盐后,具有很强的色泽。,2、气相色谱法,在20世纪70年代GC-MS已被用于同化激素的分析。20世纪80年代出现的毛细管GC使GC-MS结构简化、仪器成本下降。毛细管GC和SIM检测方式使GC-MS发展成为一种成熟的、集高效分离、高灵敏度检测和结构鉴定为一体的分析技术。目前,GC-MS已成为同化激素残留分析中普遍采用的方
33、法。,SIM检测：选择离子监测技术,同化激素及其代谢产物的结构中含有多个羟基或酮基等极性基团,为高极性、难挥发、热稳定差的化合物,GC法难以直接分析,因此需衍生化使形成易挥发、热稳定性好的衍生物,以提高其色谱性能。由于它们的结构中含羟基和酮基,常用的衍生方法包括硅烷化、酰化和肟化。,例子：,1992年,Daeseleire等报道了GC-MS法测定牛肉和牛尿中多种同化激素(去甲睾酮、睾酮、雌二醇、炔雌醇、孕酮、群勃龙、玉米赤霉醇、己烯雌酚、去氢睾酮、美雄酮、甲睾酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮、氯睾酮、醋酸氯睾酮)的残留。样品用葡萄糖苷酸/芳基硫酸酯混合酶水解,经液-液萃取和固相萃取
34、柱净化,再通过HPLC纯化,分别收集含分析物的五段馏分,衍生后GC-MS检测。,1997年,Hartmann等报道了GC-MS法测定牛肉组织中类固醇激素,包括雄烯二酮、雄酮、睾酮、孕酮、雌酮、雌二醇、脱氢表雄酮、二氢睾酮、表睾酮、羟孕酮、孕烯醇酮、雌三醇、甲基睾酮和甲羟孕酮。2003年,Dickson等采用GC-MS法筛选和确证牛尿中己烯雌酚、双烯雌酚、己烷雌酚和玉米赤霉醇的残留。2005年,Seo等报道了GC-MS法同时测定肌肉中多种促生长激素(雌二醇及其代谢物、睾酮、孕酮、玉米赤霉醇、已烯雌酚)。,3、液相色谱法,HPLC比GC更常用于激素的分析。雌性激素的分析：分析极性较大的雌激素结合物
35、常采用阴离子交换色谱法或反相离子对色谱法,尤其是后者分离效果更好。环糊精色谱也被用于雌激素的分析,该法能有效地分离结构异构的雌激素结合物。雌二醇和雌三醇在200nm处有一中等强度的较尖的紫外吸收峰,在280nm处有一较宽的弱吸收峰。,此外,雌二醇和雌三醇还具有天然荧光。浓度较高的生物样品,采用紫外检测能获得足够的灵敏度,也可利用天然荧光的特性而采用荧光检测,后者尤其适合测定较低的残留量,但因雌酮无法利用荧光检测,实际工作中常将紫外检测器与荧光检测器结合使用以提高检测能力。可食动物组织中雌激素的浓度较低,采用电化学检测可获得较高的灵敏度。将激素进行化学衍生化后可采用荧光检测或化学发光检测。,孕酮
36、和睾酮在240nm处有较强紫外吸收,紫外检测RP-HPLC法是分析生物样品的主要方法。一般紫外检测可获得足够的灵敏度,但荧光检测更适合于组织样品的测定。动物组织中的玉米赤霉醇和己烯雌酚的残留量通常为g/kg级,为获得足够的检测灵敏度,可采用电化学检测或质谱检测。,雄性激素的HPLC分析：,RP-HPLC和NP-HPLC均被用于雄激素的分析。体液中睾酮含量较高时,可采用紫外检测;否则,可将睾酮与衍生化试剂反应制备成荧光衍生物后再用紫外检测,或采用高灵敏度的荧光检测器进行检测。甲睾酮的分析常用RP-HPLC法,一般情况下,采用紫外检测能获得足够的灵敏度,但肌肉组织中甲睾酮代谢物残留量通常为g/kg
37、级,且甲睾酮代谢物的分子结构中无生色团,无法利用紫外检测,有报道采用柱后固定化酶衍生化结合荧光检测的方法,其定量限为1g/kg。此,HPLC-MS法在睾酮分析中也有应用。,Lagana等报道LC法检测鸡肉、牛肉和牛肝中9种同化激素(群勃龙、睾酮、孕酮、雌二醇、己烯雌酚、左环十四酮酚、玉米赤霉烯醇、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇)残留。Andresen等报道了LC法测定脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮的残留量。万美梅等采用LC-电化学检测法测定动物组织中己烯雌酚残留量。Davoli等报道了在线萃取液相色谱/快速原子轰击质谱法测定鼠和牛尿中己烯雌酚的残留。,Fang等报道了LC-MS/MS法测定鸡和兔肝中玉米赤霉醇残留量。秦燕等建立了不同动物肌肉中类固醇同化激素(表睾酮、丙酸睾酮、19-去甲基睾酮、甲基睾酮、孕酮、甲羟孕酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮)多残留的LC-MS/MS分析方法。,
