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1、组织分布,组织分布的研究内容,一.研究组织分布的意义二.组织分布的研究方法三.研究实例四.改变药物组织分布的方法,一.为什么要进行药物组织分布研究？,1.药物在组织中的浓度与药理效应直接相关：药理效应取决于靶器官的浓度，药物的组织分布与药理效应的产生更加密切。2.药物在血液的浓度与药理效应间接相关：一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。,3.一般而言，检测药物在血液中的浓度比检测药物在组织中的浓度要简单，所以一般采用血药浓度代替组织浓度。4.当药物在组织
2、中的分布极不均匀时，检测药物在组织中的浓度更加合理、科学。5.组织分布研究可使药物提高疗效、降低毒性、指导制剂设计。,二.实验方法,（一）基本要求（二）分析方法的验证,（一）基本要求,1.动物的选择 小鼠 大鼠 注：药动学研究的动物选择：与药效一致,2.给药剂量 选择一个剂量（一般以有效剂量为宜）给药 注意：药动学研究需高、中、低三个剂量,3.时间点的选择 1)至少吸收相、分布相和消除相各取一个点 2)上升相、下降相 3)静脉注射 注意：每个时间点至少应有5只动物的数据。,4.检测样品的选择 1）心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉 2）子宫或睾丸 3）效应靶器官、毒性靶器官。,5.样品的前处理 取样
3、：各组织器官用滤纸吸干残留血，生理氯化钠溶液充分冲洗，用滤纸吸干，称重，分别取各组织1g（不足1g，取全量），加四倍量的生理盐水匀浆。前处理：去除蛋白质；可使结合型的药物释放出来，以便测定药物的总浓度；其方法有有机溶剂、盐析、加酸等。,（二）分析方法的验证,生物样品的特点：1）取样量少 2）药物浓度低 3）内源性物质干扰 4）个体差异大,基本参数,生物样品分析方法的基本参数包括：1.准确度2.精密度3.特异性4.灵敏度5.重现性6.稳定性,1.特异性,特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等。内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测
4、定。试验报告(论文)中应提供:1）被试验药物标准样品的色谱图 2）正常生物样品（空白匀浆液）的色谱图 3）空白生物样品（匀浆液）外加被试药物的色谱图 4）给药后的生物样品的色谱图,2.标准曲线与定量范围,标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法（如用加权最小二乘法）获得标准曲线。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。用至少5个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该
5、点。检测限 定量限,3.精密度,要求选择3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品，为获得批间精密度，应至少连续3个分析批合格。精密度用质控样品的批内（天内）和批间（天内）相对标准差（RSD）表示，相对标准差一般应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%。,分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。质控样品：即QC样品，系指在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于监测生物分
6、析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。标准样品：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。,4.准确度（方法回收率）,准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。准确度一般应在85%115%范围内，在定量下限附近应在80%120%范围内。,5.定量下限,定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定35个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/101/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%120%范围内，RSD应小于20%。应由至少5个标准样品测试结果证明,6.样品稳定性,目的：确定生物样
7、品的存放条件和时间。方法：1）生物样品在处理前,室温、4放置放置的稳定性。2）生物样品经处理后,待测样品放置一定时间的稳定性 3）多次冻-融的稳定性：用来考察生物样品经较长时间的低温存放的稳定性,以确定质控样品能否长期存放。,7.提取回收率,定义：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。方法：高、中、低3个浓度 有机溶剂的标准品峰面积与空白生物介质经提取后的峰面积之比。,小结,1.准确度：在确定的分析条件下，测得值与真实值的接近程度。2.精密度：在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。3.特异性：分析方法测量和区分共存组分中分析物的能力。这
8、些共存组分可能包括代谢物、杂质、分解产物、介质组分等。4.灵敏度：生物样品分析方法的灵敏度通过标准曲线来表征，主要包括定量下限和浓度-响应函数。5.重现性：不同试验室间测定结果的分散程度，以及相同条件下分析方法在间隔一段短时间后测定结果的分散程度。6.稳定性：一种分析物在确定条件下，一定时间内在给定介质中的化学稳定性。7.标准曲线：试验响应值与分析物浓度间的关系。应采用适当的加权和统计检验，用简单的数学模型来最适当地描述。标准曲线应是连续的和可重现的，应以回归计算结果的百分偏差最小为基础。,8.提取回收率：分析过程的提取效率，以样品提取和处理过程前后分析物含量百分比表示。9.定量范围：包括定量
9、上限（ULOQ）和定量下限（LLOQ）的浓度范围，在此范围内采用浓度-响应关系能进行可靠的、可重复的定量，其准确度和精密度可以接受。10.生物介质：一种生物来源物质，能够以可重复的方式采集和处理。例如全血、血浆、血清、尿、粪、各种组织等。11.介质效应：由于样品中存在干扰物质，对响应造成的直接或间接的影响。12.分析批：包括待测样品、适当数目的标准样品和质控样品的完整系列。一天内可以完成几个分析批，一个分析批也可以持续几天完成。13.标准样品：在生物介质中加入已知量分析物配制的样品，用于建立标准曲线，计算质控样品和未知样品中分析物浓度。14.质控样品：即QC样品，系指在生物介质中加入已知量分析
10、物配制的样品，用于监测生物分析方法的重复性和评价每一分析批中未知样品分析结果的完整性和正确性。,实例1：贝母素甲组织分布研究,1.组织样品的制备空白大鼠拉颈处死后摘取其心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、子宫、卵巢，脂肪，肌肉，皮肤，取样部位尽量一致，各组织器官用滤纸吸干残留血，用生理氯化钠溶液充分冲洗，用滤纸吸干，称重，分别取各组织1g（不足1g，取全量），加四倍量的生理盐水匀浆。取匀浆液0.7ml，加6ml生理盐水稀释，取稀释液0.5ml进行样品处理：分别加50ul甲醇和卡马西平（内标）(2ug/ml)50ul，涡旋混合1min,加入氨水50ul，涡旋振荡2min，加入乙酸乙酯2ml，涡旋振荡5
11、min，4000r/min离心10min，取上清液，于40水浴下用氮气吹干，残渣用200l乙腈-甲酸铵水（35：65）振荡溶解，0.22um微孔滤膜过滤后，取10l进样。,2.方法学考察2.1专属性考察取空白的组织匀浆液0.5ml（以脾脏为例），除不加入内标外，其他均按样品处理方法处理，获得空白样品色谱图.加入50ul对照品，除不加入甲醇外，其他均按样品处理方法处理，获得标准品色谱图.取给药后的大鼠组织样品，按样品处理方法处理后，得样品色谱图。,2.2 标准曲线和线性范围取空白组织匀浆液0.1ml，加入贝母素甲的系列标准溶液0.01ml和内标溶液0.01ml，涡旋混合1min即得组织浓度分别为
12、1,2.5,5,25,50,100,250,500 ngmL-1的组织标准溶液，除不加0.01ml甲醇外，建立标准曲线。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，进行线性回归运算，求得的直线回归方程。,2.3 方法的精密度和准确度考察取空白组织匀浆液0.1ml，按“标准曲线和线性范围”项下的方法制备贝母素甲低、中、高三个浓度的质量控制（QC）样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，并与标准曲线同时进行，计算QC样品测得的浓度，与配制浓度对照，求算方法的准确度和精密度，,2.4 提取回收率考察取空白组织匀浆液0.1ml，按“标准曲线和线性范围”项下的方法制备3种药物低、中、高
13、三个浓度的质量控制（QC）样品，将样品的峰面积与未经处理的标准溶液峰面积进行比较以考察样品及内标的提取回收率。,2.5 样品稳定性考察取空白组织匀浆液0.1ml，分别将样品室温放置6h，-20放置14d,-20冷冻-室温融化循环3次后，除不加0.01ml甲醇外，按照“血浆样品预处理”项下操作，测得的药物浓度与新配制的QC样品进行比较。,提取物组织分布图例,提取物灌胃给药后贝母素甲雌雄大鼠体内分布图,雌性,雄性,卵巢,子宫,取样点时间的选择？,单体与提取物分布研究,贝母素甲单体灌胃后在大鼠体内的组织分布存在明显的性别差异，雄性组织中的贝母素甲含量明显高于雌性，雌性大鼠体内的主要分布在雌性的性器官
14、。意义：剂量确定时应该考虑性别差异。,实例2.麦冬多糖MDG-1静注给药后各组织分布研究,研究思路,MDG-1抗心肌缺血作用研究,整体实验口服有效,口服吸收机制研究,如何促进口服吸收?,抗心肌缺血机理,是否与心肌细胞保护有关?,细胞药效,静注有效,体内药动学特征?心脏等组织分布如何?从分布探讨抗心肌缺血机理,须建立灵敏度更高的分析方法,如何满足分析要求?,（一）正常动物静注给药后各组织分布研究1.组织样品高效凝胶色谱分析方法的建立（略）2.大鼠体内各组织中MDG-1浓度的测定,取样点时间的选择？,数据处理,根据MDG-1静注后各组织的浓度绘制浓度-时间曲 线，梯形法计算各组织中药物的AUC。,
15、大鼠各组织50 mg/kg静注后AUC值,小结：组织分布数据处理方法1.直观比较各取样点药物含量的差异2.AUC,结 果MDG-1静脉注射后，大多数容易聚集在肾脏，并以尿的形式排泄。根据各组织AUC值，其他组织中含药量分布顺序从高到低依此为：肺，胃，心，脾，肝，脑，心脏对多糖MDG-1表现出有一定的摄取能力。,（二）MDG-1在生理组和心肌缺血组（模型组）的心脏分布比较,1.心肌缺血模型的制备（略）2.组织分布比较研究,*,*,*,图 正常组与心肌缺血组多糖分布比较（*P0.05,*P0.01,心肌缺血组与正常组比较）,心肌缺血组各个时间点多糖分布情况，除30min时间点外，其余各时间点均比正
16、常组的分布明显增多，且经统计有显著性差异,本课题意义,1.正常动物组织分布实验：（1）MDG-1静注后，大多数在肾脏分布，排泄快：MDG-1的峰尖（分子量分布）分子量约5000；粒径2.0nm；低于肾小球的截留值。（2）提示对MDG-1进行结构修饰，如PEG化，增加其分子量使肾清除减少，则多糖可更多地在系统循环，更好起效。,结合前期麦冬多糖的离体药效实验、心肌细胞药效实验均表明其具有显著抗心肌缺血的结论以及从药动学组织分布整体性研究得出的麦冬多糖在正常与缺血大鼠的组织分布特点，则可推论麦冬多糖MDG-1有效抗心肌缺血的可能机理是麦冬多糖直接作用于靶器官的病变部位起效。,2.模型动物：从药动学组
17、织分布整体性研究得出的麦冬多糖在正常与缺血大鼠的组织分布特点，则可推论麦冬多糖MDG-1有效抗心肌缺血的可能机理是麦冬多糖直接作用于靶器官的病变部位起效。,四.改变药物组织分布的药剂学方法,实验：异长春花碱脂质体的制备及其在小鼠体内的组织分布,背景：1.异长春花碱是从长春花中提取的一种半合成的长春花生物碱。2.现代药理表明，VRB可用于治疗乳腺癌、支气管肺癌、软组织肉瘤及神经母细胞瘤等。3.但由于VRB具有明显的毒副作用。4.因此为了提高VRB的水溶性及靶向性，将VRB用脂质体为载体进行包裹，测定VRB脂质体在小鼠体内的分布，并与普通VRB注射液进行比较。,结果：制备的VRB脂质体的平均粒径为
18、158.3 nm，脂质体外观圆整、大小均匀，可见明显的双分子层结构；与VRB注射液比较，VRB脂质体在模型小肝、脾、肿瘤中3 个时间点的分布均明显增强（P0.05 或P0.01），其余组织分布无明显变化；VRB脂质体对模型小鼠具有明显的肝、脾、肿瘤靶向性及一定的肺靶向性。结论：所制备的VRB脂质体对肺癌模型小鼠肿瘤组织具有明显靶向性。,（一）药物的体内命运,1.常规制剂的体内命运（VRB 注射液）VRB分子或离子 跨毛细血管膜 组织 细胞 特点：基于药物理化性质、与组织亲和力的分布特性 2.微粒给药系统（VRB 脂质体注射液）VRB微粒 基于粒径的机械栓塞特定组织 吞噬 特点：基于微粒粒径的组织分布，与药物本身的性质无关。,（二）提高药物靶向性的方法,1.微粒给药系统：微球、微囊、脂质体、纳米粒。（粒径、电荷）2.结构修饰的微粒给药系统,3.磁性微粒 4.热敏微粒 5.PH敏感微粒,习题,1.药物的血浆蛋白结合率、组织蛋白结合率对表观分布容积的影响。2.基于分布的药物配伍毒性研究。3.基于分布的药物微粒给药系统设计的研究进展。,
