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1、细菌与生物制药,吴震州,课程教学的基本要求,了解生物制药的概念了解常见的用于制药的细菌了解细菌用于生物制药的发展方向,定义：利用细菌技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。,一、细菌生物制药的背景和定义,生物医药发展背景,在过去10年，研发成本飙升，但每年上市新药数目下降,到2005年，前一百位的处方药中有53%将专利到期，它们在1998年的销售收入达到530亿美元几乎都是畅销药。专利到期对公司价值的影响是巨大的，曾有药企的某专利到期药品在两个月内
2、失去了80%的市场份额。,大量专利药品面临到期,现有的模式正受到很大的挑战,研发生产率,治疗药的竞争,医生对某种药的使用时间,支付者成本控制,医药行业的未来,新的产品开发模式提供了美好的前景一种以“疾病为导向”的方式释放分子科学的能量新方式将转变从被动为主动医药研发过程,对疾病的重新定义,过去,肺病,器官,将引导未来的治疗方法,现在,Lung Disease,器官,类固醇,1、微生物菌体的发酵,SCP生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂（乳酸菌、双歧杆菌）,二、生物制药中细菌的发酵类型,2、酶发酵,各种酶制剂糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌纳豆激酶、链激酶：治疗血栓青霉素酰
3、化酶：青霉素生产,需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。,3、微生物代谢产物发酵,初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感,4、微生物转化发酵,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。,如
4、：甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物,Nisin 的肽链结构,Nisin 的生物合成,药用发酵产品分类,生物来源,作用对象,作用机制,化学结构,细菌真菌放线菌,抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂,抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药,抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂,细菌发酵制药的特点,微生物菌种选育获得高产发酵的理论产量存在约10%的变量发酵过程常温常压，操作条件温和纯种培养、无菌条件生产过程是以生物体的自动调节方式进行的分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段投资少、见效快,发展趋势,利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、
5、新的工程菌和新型微生物的开发新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素促红细胞生成素等；新型菌体制剂和疫苗。,红细胞生成素(治疗贫血)生长激素(促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、抗肿瘤),三、生物制药中的细菌,微生物产生的生物药物,微生物来源药物的特点；微生物药物的定义微生物药物的种类；抗生素；微生物来源药物的研究前景。,微生物来源药物的特点,资源丰富；容易改造：能将现代生物技术应用到微生物育种中；生产简单，易于实现工业化生产，设备通用。,微生物药物的定义,由微生物在其生命活动过程中产生的具有生理活性（或称药理活性）的初级或次级代谢产物及其衍生物；应用微生物直接合成或通过微生
6、物转化生产的临床上治疗人类多种疾病的药物。,次级代谢产物,次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，他们可能积累在细胞内，也可能排到外环境中。,微生物来源药物的种类与用途,抗微生物感染的抗生素,抗肿瘤抗生素,500余种。主要有蒽环类、丝裂烷类、博莱霉素类、色霉素类，放线菌素类，烯炔类抗生素。目前，阿霉素、丝裂霉素、博莱霉素（争光霉素）、放线菌素D（更生霉素）、红比霉素（正定霉素）、平阳霉素等已成为肿瘤治疗中常用的药物。,微生物产生的酶抑制剂
7、,酶抑制剂(PI)：对特定酶有抑制作用的小分子量蛋白质。在调节酶活性和物质代谢等方面起着重要的作用，近年来发现在许多疾病及病理过程中有控制作用；人胆固醇合成限速酶 HMG-CoA还原酶抑制剂微生物来源的新型降血脂药；举例：半乳糖苷酶抑制剂可扰乱膜上与特定蛋白连接的聚糖，从而可用于抗艾滋病毒的感染和肿瘤细胞转移。,酶抑制剂举例1,-葡萄糖苷酶抑制剂：影响碳水化合物吸收，主要降糖机制为：抑制小肠刷状缘上各种-葡萄糖苷酶，使多糖分解为葡萄糖的速度减慢。-葡萄糖苷酶抑制剂 代表药物有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖。优点：降低餐后血糖而对降低空腹血糖无作用、安全和不增加胰岛素分泌。,酶抑制剂举例2,H5
8、N1神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒是一个鉴定禽流感病毒H5N1神经氨酸酶抑制剂的试剂盒。禽流感病毒在其外壳上有两种糖蛋白：H血凝素Hemagglutinin，N神经氨酸酶（也称唾液酸酶）Neyramidinase血凝素H病毒入侵的“开路先锋”，和细胞膜上的蛋白结合，在细胞膜上打开一个通道，使得病毒能进入细胞。N通过水解的方式切断病毒和宿主细胞膜的最后联系，使病毒脱离寄主细胞。,微生物产生的受体拮抗剂,受体与配体的相互作用：受体与相应的配体（ligand）有高度亲和力，并能特异性结合，也可被配体饱和；如激素等的作用；新药发现的重要策略之一，药物作用靶位有45是受体。,受体拮抗剂举例1,炎症：炎症是机
9、体对各种致炎因素引起组织损害而产生的一种基本病理过程，它和许多难以治愈的自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、免疫缺陷疾病、癌症、心血管疾病等具有密切关系。炎症反应和免疫应答密切交织，参与炎症反应的细胞因子众多。以炎症细胞因子受体为靶位建立受体拮抗剂可以达到降低细胞因子活性、治疗炎症等疾病的目的。依博素对类风湿性关节炎有明显的抗炎镇痛活性。,受体拮抗剂举例2,丙谷胺（蒙胃顿）作用机理：为胃泌素受体拮抗剂，有抑制胃酸和胃蛋白酶分泌的作用。功能：于十二指肠溃疡，尤适用于慢性胃酸过多所致的溃疡、胃炎。,微生物产生的免疫调节剂,免疫反应：机体防御机制，自稳机制；免疫调节剂：影响机体免疫功能的物质；免疫增强剂
10、：促进低下的免疫功能恢复正常或防止免疫功能降低的药物，如干扰素；免疫抑制剂：抑制与免疫有关细胞的增殖和功能，减低机体免疫反应。,Why？,免疫抑制剂举例,器官移植中，抑制移植物抗宿主反应和宿主抗抑制反应。风湿性疾病（人体的免疫功能亢进引起）：免疫抑制剂。目前常用的免疫抑制剂有烷化剂，如环磷酰胺和抗代谢药，甲氨喋呤及硫唑嘌呤等。,第三章 微生物制药,第38页，共122页,抗微生物,抗微生物,抗肿瘤,抗肿瘤,抗生素,抗微生物抗生素：按结构的分类；作用模式和位点；抗药性。抗肿瘤抗生素；抗生素的定靶筛选模型。,第三章 微生物制药,第44页，共122页,微生物的抗药性机制：缺乏某类药物作用的结构；化学治
11、疗剂不能穿过细胞膜进入胞内；化学治疗剂被变为无活性的形式；药物的作用部位被修饰改变；被药物阻断的代谢途径发生遗传改变；将进入到胞内的药物泵出胞外。未来抗生素能降低细菌耐药性。美国科学新闻网站：将来最有效的抗生素可能并不杀死任何细菌。相反，这些药物仅仅是阻止细菌间的相互“交谈”，即干扰细菌之间不断传递的分子信号流等方法。,常见的制药用微生物,细菌之大肠杆菌属(Escherichia coli),生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物基因工程的载体,细菌之短杆菌属(Brevibacterium),维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。,细菌之棒状杆菌
12、属(Corynebacterium),生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542,细菌之芽孢杆菌属(Bacillus),生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。,细菌之假单胞菌属(Pseudomonas),生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。,细菌之乳酸杆菌属(Lactobacillus),生产抗癌类药物,放线菌,抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。,放线菌之链霉菌属(Streptomyces),灰色链霉菌(Strepto
13、myces griseus)产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces aureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)产红霉素龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)产土霉素,放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia),生产利福霉素、蚊霉素等,放线菌之小单胞菌属(Micromonospora),多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。,微生物来源的具有新型抗肿瘤作用机制的生理活性物质,具有抗肿瘤作用的酶抑制剂,近年来微生物药物研究人员主要是以与某种肿瘤的发生、转移等有关的酶作为靶来筛选抗肿瘤药物。蛋白
14、激酶抑制剂 二酰基甘油醇激酶抑制剂 DNA拓扑异构酶抑制剂 法尼基转移酶抑制剂 芳香酶抑制剂 谷胱甘肽转移酶抑制剂 硫氧还蛋白抑制剂 型胶原酶抑制剂与细胞外基质黏附成分抑制剂,蛋白激酶抑制剂,蛋白激酶是一种磷酸转移酶，蛋白激酶与细胞内的信使系统有着密切的关系。蛋白激酶A(PKA):cAMP依赖性的蛋白激酶 蛋白激酶C(PKC):依赖于Ca2+和磷脂的酶 酪氨酸蛋白激酶(PTK):逆转录病毒致癌基因的编码蛋白人的上皮癌、脑癌、白血病细胞等均发现与PTK活性有关，它与细胞的恶变和增值也有关。从微生物中寻找蛋白激酶抑制剂主要是筛选PKC和PTK的抑制剂。,从链霉菌No.126中分离得一淡黄色针晶物质
15、UCN-01，是一个PKC的选择性抑制剂，对PKA和酪氨酸转移蛋白激酶的抑制作用较弱。研究表明它对HeLaS3细胞的生长也显示细胞毒性，IC50为4.110-3ug/ml，在体内具有抗肿瘤活性，对P388淋巴白血病鼠一次腹腔给药15mg/kg，24%生存期短期延长。,1.PKC抑制剂,星报菌素(STR)是从微生物Saccharothrix中筛选获得的，具有抑制PKC的活性，同时它对多种蛋白激酶如PKA、PKG、PTK、肌球蛋白轻链激酶等都有抑制作用，是一种非选择性的酶抑制剂，因此主要是开发它的衍生物，并寻找对PKC具有高度选择性的这类化合物。从芽枝酶中分离得一暗红色物质UCN1028A，对PK
16、C和PKA的IC50分别为0.19ug/ml和40ug/ml。显示出强的细胞毒性，对肿瘤细胞MCF-7和HeLaS3的IC50分别为0.21ug/ml和0.29ug/ml。,2.PTK抑制剂,根据结构可以分为：受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)：如EGFR(表皮生长因子)、PDGFR、FGFR、IR等 非受体酪氨酸蛋白激酶(NRTK)：如Src、Abl、FAK、janus激酶等它们对调解肿瘤细胞的生长及分化起到重要的作用，但PTK的过度表达导致PTK活性增加将严重影响下游信号转导，如EGFR及HER-2的过度表达经常在一些癌细胞中发现，PTK的活性已经成为细胞增殖恶变的标志之一。因此人们利用PTK抑
17、制剂来抑制肿瘤细胞及一些增生疾病。,4,5,7-三羟基异黄酮来源于假单胞菌属，是PTK的特异性抑制剂，可抑制包括EGFR、pp60v-src等酪氨酸蛋白激酶，以及抑制完整的A431细胞中PTK活性。近年来对4,5,7-三羟基异黄酮进行的体外抑制肿瘤细胞生长的研究较多，对乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株、大肠癌细胞株等多种细胞都有明显的体外抑制活性。但对其诱导细胞凋亡的机制尚不清楚，能否在临床上用于多种癌症的治疗还需进一步研究。,四、微生物来源药物的研究前景,分离筛选产生新的生物活性物质的菌株；选育高产菌种；改进发酵装置和发酵工艺；将现代生物技术应用到生产实践中；基因工程等在微生物发酵制药中的应用。
18、,微生物药物创制的途径、方法与新技术的应用,扩大微生物来源，寻找新的有药用价值的生理活性物质；建立新的筛选模型，寻找非抗生素类生理活性物质；应用定向生物合成和突变生物合成的原理寻找新的次级代谢产物；对已知化合物进行化学改造（如半合成）寻找效果更好的生理活性物质；利用基因工程技术构建新的微生物工程菌株，这一技术与手段的应用一方面可以大幅度提高产率，另一方面可以获得新的化合物。,举例：高通量药物筛选平台简介,Thp,Th1,Th2,Treg,Th17,IL-12TGF-,IL-4,STAT-6,TGF-,TGF-IL-6,IFN-TNF-,IL-4IL-5IL-13,IL-10,IL-17,ROR
19、t,Foxp3,GATA-3c-Maf,T-bet,肿瘤、关节炎、肠炎、肝炎、系统性红斑狼疮、哮喘等,细胞因子与疾病,新技术在微生物新药创制中的应用,组合生物转化技术；组合生物合成技术；基因芯片基因组技术；RNA聚合酶功能修饰技术;核糖体工程技术。,组合生物转化技术,组合生物转化是指利用一种以上具有特殊转化功能的微生物或酶，对同一个母体化合物进行组合转化，以得到化学结构多样性的化合物。例如，用几种不同的酶对一个腺苷分子进行两轮催化，可以得到 种各种类型的衍生物。该方法是从已知化合物中寻找新型化合物的有效手段。,组合生物合成技术,组合生物合成技术是指对微生物次级代谢产物合成途径中涉及的一些酶的编
20、码基因进行互换组合，由此产生一些非天然的基因组或杂合基因，从而产生许多新的“非天然的天然化合物”，它是组合化学的有益补充。国外有学者从红霉素等抗生素的生物合成基因着手，进行组合生物合成的研究，当前应用最多的是聚酮类化合物 的组合生物合成，如红霉素、利福霉素的重组与改造。此类抗生素涵盖了大环内酯类、四环类、蒽环类和聚醚类抗生素，其生理活性包括抗感染、抗肿瘤和抗寄生虫等，极有研究价值。,基因芯片基因组技术,其原理是根据微生物基因组研究的成果，确定目标基因的 序列，设计和合成针对每个基因的寡核苷酸，并连接到芯片的微孔，通过样品杂交，扫描获得相关的信息，应用计算机处理，从中发现重要的数据。该技术已用于
21、获得高产抗生素,聚合酶功能修饰技术,聚合酶能够把 DNA序列中的遗传信息转录为RNA信息，是基因表达的第一个环节，也是表达调控的关键靶位，通过修饰 聚合酶的功能可以调节某些抗生素的生物合成水平，有研究表明，引入利福平的抗性能够导致多种编码的聚合酶 亚基因的突变，朱宝泉等通过筛选利福平抗性突变株，经系列考察，确定不同的突变对突变株的生长和抗生素生产产生完全不同的影响，暗示 聚合酶的结构和功能与抗生素生物合成基因的表达存在一定的关系。,核糖体工程技术,细胞生物学和分子遗传学研究揭示核糖体的功能是负责把编码在RNA 中的遗传信息翻译为功能蛋白质。研究表明，通过修饰核糖体的功能能够活化或加强微生物合成抗生素的水平，证明核糖体工程技术能够应用于微生物药物的研究，这一方法已经成功地应用于抗生素生产菌种的选育和新抗生素的发现。,其他细菌生物医药策略,口服疫苗 食品级细菌和食品级表达载体活菌胶囊,治疗用活菌胶囊,谢 谢！,
