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1、第二章离体培养基本技术,第一节 实 验 室 设 置,实验室组成,基本设备配置,培养容器与用具,1.实验室组成,细胞工程实验室三个基本需要实验准备:培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。,细胞工程实验室的基本要求,如有条件还应该有辅助实验室,基 本 实 验 室,准备室(配制室、洗涤室、灭菌室)功能：进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室 功能：进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。培养室（最好安装定时器）功能：对离体材料进行控制培养。首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。
2、另外，驯化移栽室（温室）,辅 助 实 验 室,细胞学实验室 功能：对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 功能：进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,细胞工程实验室布局的基本要求是：便于隔离便于操作便于灭菌便于观察。,2.基本设备配置,基本设备,灭菌设备,光照培养室与设备,无菌操作设备,细胞学鉴定设备,天平，冰箱，酸度计，纯水器,活性成分过滤灭菌,接种工具随时消毒,培养基灭菌,玻璃器皿
3、灭菌,3.培养容器与用具(略),玻璃容器 塑料容器 金属用具 塑料用具,倒置显微镜,研究显微镜,激光共聚焦,显微操作仪,常用药品药品等级：分析纯(Analytical reagent,AR).化学纯CP.在购置药品试剂时应多留意一是名称问题，同物异名的情况较多二是质量问题，假冒与劣质的情况较多同一厂家的质量也不是很稳定，因此，最好能够试用后再确定。,1、硝酸铵2、硝酸钾3、氯化钙（无水或二水4、硫酸镁（七水）5、磷酸二氢钾：酸性6、碘化钾7、硼酸8、硫酸锰（无水，一水，四水，五水，七水多种）9、硫酸锌（七水）10、钼酸钠（无水或二水）11、氯化钴（六水）12、乙而胺四乙酸二钠13、硫酸亚铁,1
4、4、甘氨酸（氨基乙酸）15、肌醇（环己六醇）16、烟酸（维生素B5）17、盐酸吡多醇（维生素B6）18、盐酸硫胺素（维生素B1）19、腺嘌呤（AD）20、6-卞基腺嘌呤（6-BA）21、萘乙酸（NAA）：、型22、赤霉酸（GA3）23、蔗糖24、琼脂（洋菜）或卡拉胶,仪器设备 1.天平：0.1，0.001，0.0001 2.高压蒸汽灭菌锅：手提式，立式，卧式，全 自动式。3.超净工作台（0.3m，24-30mpm）4.无菌室 5.电冰箱 6.烘箱（干燥箱）7.酸度计（或pH试纸）8.微波炉（电磁炉或电炉）9.细菌过滤器,10.真空泵 11.紫外灯 12.红外灭菌器 13.显微镜、解剖镜 14.
5、蒸馏水器 15.空调机 16.振荡培养器（摇床60-120次/min，冲 程10cm）、旋转培养器（转床，4rpm）17.悬浮培养装置 18.培养架（含照明灯管）,一、要求无菌原因离体培养必须在无菌条件下进行，为什么？,第二节 无菌技术,原因：植物免疫系统被破坏植物细胞的分裂速度远低于微生物细胞如果培养基有微生物，微生物的增殖速度会占据绝对优势，使培养系统污染并导致培养材料死亡外植体和培养基都不能携带细菌或真菌 需要对外植体和培养基进行彻底灭菌，并 在无菌条件下进行操作。,无菌技术涉及：材料、培养基、器皿和接种工具的灭菌，操作环境和工作台面的灭菌。处理方法：物理灭菌法：指采用加热、辐射等物理手
6、段达到灭菌目的的方法。分为加热灭菌法、过滤除菌法、紫外线照射法、微波灭菌法、辐射灭菌和离心沉淀法。化学灭菌法：是指用化学药品来杀灭微生物的方法。包括：消毒剂消毒法和化学气体灭菌法。,二无菌技术,物理灭菌法：1、加热灭菌法：分为干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下湿热灭菌的效果比干热好，主要是因湿热灭菌时有水分存在，蛋白质易变性，湿热的穿透力比干热大。,（1）干热灭菌法火焰灭菌法：系指用火焰直接烧灼以达到灭菌的目的。干热空气灭菌法：系指用烘箱等设备用高温干热的空气灭菌的方法。,（2）湿热灭菌法：利用饱和水蒸汽或沸水等杀灭微生物方法，包括以下几种方法：热压灭菌法：本法系指在热压灭菌器内，利用高压饱
7、和水蒸汽杀灭微生物的方法。流通蒸汽灭菌法和煮沸灭菌法：系指在常压下用100的水蒸汽或用水煮沸以杀死微生物的方法。低温长时灭菌法(巴氏杀菌，62.8/30min),2、过滤除菌法系指使药液通过除菌滤器中的适宜滤材，机械滤除，活的或死的细菌，得到不含细菌药液的方法。,3、紫外线灭菌法：紫外线可使微生物核酸蛋白变性死亡，同时空气受紫外线辐射后，产生微量臭氧，也起灭菌作用。4、微波灭菌法：水可强烈吸收微波，使其极性分子转动，分子间的摩擦而生热，且升温迅速，靠热力灭菌。5、辐射灭菌法：是应用射线、射线 等射线灭菌的方法。,化学灭菌法：包括消毒剂消毒法和化学气体灭菌法。1、消毒剂灭菌法：消毒是指杀死病原微
8、生物的方法，常用消毒剂有：75%的乙醇等常用于表面灭菌。0.1-1%升汞（HgCl2）；1-5%次氯酸钠溶液；,2、化学气体灭菌法：系指用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。（1）环氧乙 烷灭菌法；（2）高锰酸钾和甲醛混合熏蒸法（按照甲醛（40%）10毫升立方米、高锰酸钾5克立方米计算用量。不同情况下，用量有所不同，但比例约为2：1）。；（3）甲醛 丙二醇或过氧醋酸等化学药品蒸 汽熏蒸法,按照灭菌对象分,培养基：高压蒸汽灭菌或抽滤灭菌；玻璃器皿：湿热(时间比培养基略长,之后进行干燥)和干热灭菌(在烘箱中加热至160-180度,后恒温保持40min)均可；金属用具：使用前干热或湿热灭
9、菌，使用中火焰灭菌或小型电热石英砂灭菌器灭菌；操作环境：熏蒸（甲 醛+高锰酸钾)3-5h;紫外线照射0.5h;2%新洁尔 灭溶液.外植体:消毒剂灭菌,一、接种室（无菌操作室）和培养室接种室是进行植物材料消毒、接种和转接的场所，它应是无尘、空气对流较轻微的非常洁净的实验室。接种室的面积不必求大。室内应安装紫外灯并有充足的照明条件。天花板及四周墙壁要光洁，不易积染灰尘，地面平坦无缝，便于彻底清洗消毒。使用平移门窗并保持密闭，安装有空调器以改善工作环境，通过空调器进行通风换气。在无菌室外，应有一小间预备室（缓冲间），备有工作服、帽子和拖鞋等。进入接种室的工作人员的衣物、鞋帽要干净，并特别注意头发、手
10、和脸要很清洁。工作时最好戴上灭菌口罩，穿上专用工作服、工作帽和拖鞋等。,接种室内的灭菌，一般是先用2的新洁尔灭擦洗，再用70乙醇喷雾，使空气中的灰尘下沉，然后用紫外灯照射约15-30min。一年中要定期用甲醛和高锰酸钾产生的刺激性气体薰蒸。另外，接种室内力求简洁，与本室工作无直接关系的物品一律不放入，以利保持无菌状态。培养室的无菌条件要求大体上类似于接种室，可利用紫外灯照射和甲醛高锰酸钾熏蒸法进行灭菌，并尽可能减少外来菌源的干扰。,二、超净工作台超净工作台置于接种室内，是进行无菌操作的工作区。超净工作台一般由鼓风机、过滤器（多级）、操作台、紫外灯和照明灯等部分组成。根据风幕形成的方向，可分为垂
11、直式和水平式两类。超净工作台的工作原理：鼓风机将空气送入由特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器”后吹送出来，由于滤清器孔径的限制，直径大于0.3m的尘埃、细菌和真菌孢子都不能通过，从而形成连续不断的无菌空气流。优点：操作方便，预备时间短，工作效率高。超净空气的流速一般为每分钟2430m，既能防止附近空气的袭扰，又不至于妨碍用酒精灯焰灼烧对器械，有利于保持材料不受污染。,在超净台工作面的上方应安装紫外灯，注意勿将紫外灯装入照明灯罩（玻璃板）内，否则不具有杀菌作用。使用操作台之前应开紫外灯15min以上，以激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子(O3)，这种气体有很强的杀菌作用，可以使紫外线没有
12、直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应关掉紫外灯，10min后方可入内。,三、试材和器具的灭菌（一）培养基和水的灭菌（高压）（二）特殊药品的除菌处理 离体培养研究中，常常要用到一些在高温高压灭菌条件下易分解或失活的药品，如IAA、GA3、酶类、维生素及抗生素等，必须用非高温的方法进行除菌处理。过滤除菌是使溶液通过孔径 0.45m的微孔滤膜，由于细菌和真菌的细胞都远远大于这一孔径，故过滤可达到去除菌类的目的。为使溶液能较快地通过滤膜，须对溶液进行抽滤或加压。另一种非高温除菌法，是用乙醚处理干燥的药品，在低温30下除去乙醚，然后溶于无菌水中。,1、器皿（具）灭菌刀，剪，镊等
13、金属器材用具，使用前浸泡在70乙醇中，用时置火焰上灼烧消毒，冷却后使用。也可将拭净或烘干的金属器材用纸包好，盛在金属盒内，用电热烘箱在160下处理1小时实现灭菌。工作服、口罩等布制品及培养皿、漏斗、吸管等玻璃器具最好采用用湿热消毒。将洗净晾干的布制品用牛皮纸包好，按照消毒培养基的方法消毒。另外，玻璃器皿也可置于电热烘箱内消毒，通常用150 40min，或120 2h，或直接在水中煮沸消毒。,2、外植体的灭菌外植体在接种之前，须经严格的灭菌，但又要注意不致于损伤外植体。由于灭菌药剂的种类不同，其杀菌力不同，所以，在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间，对不同植物种类的不同外植体，处理也有
14、不同。另外，外植体在进入消毒剂之前，应认真取材及清洗，尽可能减少其初始带菌量。下面列出主要消毒剂的使用方法，并对其性质进行简要介绍。,常用消毒剂,次氯酸钠（NaClO）：用市售的“安替福民”配制210的NaClO，处理时间530min，无菌水冲洗45次。由于它分解出具杀菌作用的氯气，灭菌处理后易于除去，无残留，既有较强的杀菌力，又对植物无害，是常用的杀菌剂。新洁尔灭：一种广谱的表面活性灭菌剂。它对绝大多数植物外植体伤害很小，灭菌效果很好。通常使用1：200稀释液处理30min或以上。,7075酒精：具有较强的穿透力和杀菌力常作为表面灭菌的第一步它具有浸润和灭菌的双重作用但不能彻底灭菌，必须结合
15、其他药剂灭菌。一般处理时间为530s。,升汞（HgCl2）：剧毒的重金属盐杀菌剂原理：Hg2与带负电荷的蛋白质结合，变性失活。使用浓度：0.10.2，时间：612min须用无菌水反复多次冲洗(5次)。使用中务必注意安全。,漂白粉：低毒有效的消毒剂一般含1020（重量/体积）的Ca(ClO)2使用浓度：510或饱和溶液。因其易吸潮分解而失效，应随配随用。,过氧化氢（双氧水）：常用612的溶液处理灭菌效果较好容易除去，不会损伤外植体通常用于叶片材料的灭菌。,有时还需在药液中加入润湿剂 使杀菌剂湿润整个组织如加入数滴或0.1的吐温（Tween）80或吐温20，或者用磁力搅拌、超声振动等方法使杀菌剂充
16、分接触外植体，以利于彻底灭菌。,对灭菌剂的要求v 灭菌效果好：彻底、安全、高效；v 对植物材料伤害小；v 灭菌剂易消除或易分解（环境污染少）。,四、无菌操作要点提前15min开机，使超净工作台自净。做好个人卫生、穿戴好工作服及口罩后，在工作台上用70酒精擦拭双手和台面，晾干双手，小心点燃酒精灯，双手尽量不要离开无菌区。在灯焰上灼烧接种工具（镊子和手术刀等），冷却备用。,取一瓶培养材料于灯焰上烧瓶口，使灰尘固定于瓶壁并杀死附着的微生物。小心打开瓶盖，将瓶盖倒扣于台面上。用镊子取出材料，在无菌纸或无菌器皿中进行切割。以同样的方法打开培养基的瓶盖，将切割好的材料接种于培养基，小心盖回瓶盖，用力拧紧。
17、接种完一批切割的材料后，清理台面并用酒精擦拭。灼烧工具，准备做下一瓶材料。为避免微生物掉落于培养瓶内，操作时应将瓶拿成斜角，并禁止大声讲话。,无菌操作注意事项：,（1）进入接种室前应洗净双手，穿好工作服，戴好工作帽。（2）接种操作前用75%的酒精擦拭双手。（3）接种操作时要端座，不要俯身工作台，口鼻远离接种区（如瓶口），尽量不要讲话。（4）打开培养瓶口（拔棉塞时和盖棉塞时）前和盖盖之前，坚持灼烧培养瓶口和盖口（或棉塞），将微生物固定，防止进入瓶内。（5）接种过程中手臂切忌从培养基、无菌材料、接种器械等物品上方经过，以免引起污染。（6）当培养容器敞着口时，应倾斜瓶口防止污染物进入培养容器。,污染
18、的主要来源：1.培养器皿；2.培养基本身；3.植物材料；4.接种室环境；5.培养室环境；6.操作器械；7.操作人员。,细菌污染？：受污染的培养基呈粘液状、混浊状或发酵起泡，并伴有明显的酸臭气味，一般在接种后35d即可表现出来。细菌污染以芽孢杆菌污染最为普遍和严重，芽孢杆菌形成芽孢后，能够忍耐一定的高温高压、消毒剂及紫外线等灭菌处理。这种污染在早期不易发现，一旦发现，造成的污染损失可能就比较大。,细菌污染,真菌污染,污染,真菌污染的特点是长霉霉的颜色可有多种，一般在接种后7d以上方可表现，长霉的部位可以是外植体，也可以是培养基。,细菌污染与真菌污染的比较,细菌污染接种后3-4天黏液状或发酵泡状菌
19、斑；出现浑浊或云雾状痕迹材料带菌；操作人员不慎；培养基灭菌不彻底,真菌污染接种后5-10天形成不同颜色和形状的霉层材料带菌；超净工作台失效；接种环境,一些特别重要的材料若被污染，可以取出清洗后进行更严格的灭菌，重新接种培养（二次灭菌）。对污染培养瓶应及时、妥善地处理，最好是在未打开瓶盖之前，把所有的污染瓶集中进行高压灭菌，清除污物后洗净备用（清理污染物）。,使用超净工作台的注意事项,超净工作台不应安装在尘埃太多的地方。在使用前应开紫外灯15-20分钟，吹风10-15分钟。操作前应先将实验材料和操作器械、药品等物品事先放入台内，不要中途拿进。台面上放置的东西不宜太多，特别是注意不要把东西迎面堆的
20、太高，以免挡住气流。定期检查，更换过滤器,第三节外植体的类型及其选择与处理,外植体:指用于接种培养的各种离体的植物材料包括胚胎材料、各种器官、组织、细胞甚至原生质体等。外植体是植物离体培养能否成功的决定因素之一。,一、外植体的类型及选择依据,1、外植体的类型及其优缺点（）茎尖是应用最多的外植体是最理想的起始材料之一茎尖是植物地上部分的雏形，具有顶端分生组织、叶原基和腋芽原基，只需诱导生根即可成为完整植株。生长速度快，不容易产生遗传变异，,另外，利用微茎尖进行离体培养，还是获得无病毒植物的一个有效途径对园艺植物的科研与生产都具有十分重要的意义。,（）茎段、花茎或花梗（带节或不带节）用带节的茎段进
21、行培养，促使节位上的腋芽萌发，实现植株的再生。花茎或花梗（变态茎）,（）叶片比较常用的外植体材料。特点：取材容易操作方便能够大幅度扩大外植体的来源,一些再生能力较强的植物种类如番茄、芥蓝、花椰菜、青花菜、玫瑰、海棠、大岩桐、倒挂金钟、矮牵牛、兰花、豆瓣绿等植物，都可采用叶片为起始材料，但由于叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。另外，对那些再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生的难度相当大。,（）花蕾和花药较常用的外植体材料，也常用来培育单倍体含有较多的分生细胞，具有较强的再生能力属于生殖器官，胚胎发生能力较强，甚至可诱导单倍体。可通过诱导胚状体的途
22、径实现植株再生,（）花瓣花瓣起源于茎尖的外围组织，花瓣比叶片更接近于卵细胞这一最幼态的区域，因而花瓣可能具有更强的再生能力当用其它种类的外植体难以获得成功时，可尝试采用花瓣材料。,（）幼胚、成熟胚、种子胚胎和种子本身就是一个结构完整的微小生命体，不需要脱分化和再分化的过程。具有较强的胚胎发生能力特别是幼胚材料，由于胚性相当强，研究中通常用于胚状体的诱导诱导率远高于其它种类的外植体。,由此看来，胚胎和种子培养，既可直接形成植株，也可先诱导胚状体后再予以转株，研究者可根据实验的目的，选择适宜发育期的胚胎材料作为外植体。,（）子叶、下胚轴子叶和下胚轴作为胚的一部分，也具有胚胎材料的特点再生能力和胚胎
23、发生能力较强，多数情况下能够直接诱导不定芽或胚状体其间可能不需要形成愈伤组织的过程诱导率较高，遗传较稳定因而被广泛应用于离体培养。,（）根尖、根段、块根、块茎、果实及汁胞都属于体细胞组织除根尖外，分化程度都比较高故一般需要脱分化形成愈伤组织和再分化的过程，才能实现植株再生再生的难度可能比较大（如果实和汁胞材料）。,2、选择依据（）外植体的生理状态（2）取材的季节（3）外植体的大小（4）其它,（）外植体的生理状态对离体培养的影响极为重要。幼嫩、生理状态活跃的材料比较容易培养，而成熟衰老、生理活性衰弱、或者是处于休眠状态的材料则难以培养。一般而言，春天植物开始生长，芽膨大而鳞片未开裂时取材最为合适
24、。,芽在植株上的部位也有影响如香石竹和菊花的顶芽或上部的芽易分化，而中下部的芽较难，可能与激素和营养水平有关。,（2）取材的季节取材季节的影响来自三个方面：一是不同的季节所提供的材料可能不同如生殖器官材料只能在生殖生长阶段取材；二是不同季节中的天气情况影响灭菌效果如在雨季取材污染率高；三是不同季节中材料的代谢情况有差异，如春夏季植株的原生代谢活跃，次生代谢不强，材料易于培养；秋冬季，植株的次生代谢趋旺盛，容易积累多糖、色素及酚类等次生物质，易导致培养材料的褐变死亡,一个较好的方法，是将植株种植于在温室内，能够克服季节与气候的影响。,（3）外植体的大小影响材料的成活与生长一方面，为了提高成活率，
25、要求较大的外植体但过大的外植体，又可能因难以彻底灭菌而增加污染。另一方面，为了提高脱毒率，又要求外植体尽量的小一般选取0.51.0cm的外植体为宜但如果是胚胎培养或脱毒培养的外植体，则可小至0.5cm以下，最小至0.1mm。,（4）其它取材时还应选择优良的基因型从健壮无病的植株上取材所选品种及试材应符合研究的目标是否容易灭菌,二、外植体的预处理及灭菌,、减少带菌的处理2、消毒剂的杀伤力和材料对消毒剂的耐受力3、清洗的重要性4、内生菌问题5、切割与接种的技巧,、减少带菌的处理减少材料的初始带菌量是最有效措施。,最好是在长期晴朗的天气条件下取材选择新萌发的幼芽或嫩梢选择表面比较光滑的材料对母株定期
26、喷洒杀菌药剂用纸袋或薄膜袋将枝条封套保护待其萌发新芽后取材在室内采用水插促芽后取材，或是在温室植株上取材等此外，对一些带菌较多的材料（如茎尖），置于水龙头下流水冲洗，可大幅减少带菌量。,2、消毒剂的杀伤力和材料对消毒剂的耐受力不同的消毒剂种类，对材料的杀伤力不相同。其渗透力和化学性质不同不同的外植体材料，对同一种消毒剂的耐受力也不相同。因其大小、结构、幼嫩程度的不同,在选择消毒剂时，考虑2个因素对微生物杀灭作用强烈对植物材料比较安全的种类。在选择外植体材料时则应优先考虑体积较大、带菌量较少、耐受力较强的类型。,对于坚硬致密的外植体材料如枣核、苦丁茶种子、柑桔种子可采用渗透力强的消毒剂（如75酒
27、精）直接进行表面灭菌或用0.1升汞处理数十分钟,3、清洗的重要性外植体经消毒剂处理后，必须用无菌水洗去残存的消毒剂否则会对外植体造成长期的伤害尤其是附着力强的消毒剂如升汞等,4、内生菌问题某些植物的外植体除表面带菌外，其内部或浅表的组织也会带菌，称为“内生菌”如兰花可在培养基中添加广谱抗生素，并通过多次继代培养逐渐消除。,5、切割与接种的技巧外植体的大小会影响成活率，故应将材料切分成适宜的大小后接种。如果用于消毒的外植体比较大，则应尽量切取其内部的组织进行接种（不带菌）；,接种的方向也比较重要茎尖、茎段如直立,须先端向上接种，也可以平放;叶片材料可用插接,也可以平放于培养基表面但平放时一般将叶
28、背朝下(有争议)，以利于对培养基的吸收。,三、褐变的防止,、褐变的原理2、影响褐变的因素（）基因型（）外植体的生理状态及发育年龄（）培养基组份的影响（）培养条件（）每代的培养时间,、褐变的原理很多植物体内含有较多的酚类化合物。尤其是木本植物在完整的植物细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶分隔存在，酶促反应不能进行。而外植体切口附近的分隔被破坏，在有氧气的情况下，多酚氧化酶催化酚类物质氧化成褐色的醌类醌类物质在酪氨酸酶等酶的作用下，使外植体细胞中的蛋白质聚合，生长停顿，最终导致死亡。,愈伤组织培养、细胞悬浮培养、原生质体培养中，也存在褐化现象。组织老化、细胞病变也会激活酚氧化酶而引起褐变,2、影响褐变
29、的因素（）基因型不同植物种类的褐变情况有很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变，木本植物中存在更多的酚类物质。,同种植物的不同类型或基因型，也有差异例如蕉类种质资源中，B组染色体组越多，茎尖褐变就越严重，繁殖成功率就越低荔枝品种中，绿沙幼胚培养褐变严重，东刘1号则较轻。,（）外植体的生理状态及发育年龄a随着年龄和组织木质化程度的增加，褐变会有所加强。荔枝（怀枝）的实生幼苗基本上不会褐变，而成年结果树枝条的褐变则相当严重；b分化程度高的材料容易褐变如叶片比茎尖容易褐变c成熟度高的材料比幼嫩材料容易褐变。d伤口创面大、外植体体积小的材料较易褐变，在取材和切割时应注意。,（）培养基组份的影响液
30、体培养基能有效地克服外植体的褐变外植体溢出的有毒物质可以很快扩散到液体培养基中，从而减轻了对外植体的危害。在液体培养基中加滤纸桥，效果更好,培养基成分对褐变也有一定的影响适当降低无机盐浓度有利于减轻褐变初代培养时.无机盐浓度过高，会引起酚类物质大量产生，加剧褐变，高浓度的蔗糖、丝氨酸、铵态氮、硼素及细胞分裂素类的BA、KT等具有促进多酚合成或刺激多酚氧化酶活性的作用，加剧褐变发生生长素类如2，4-D和NAA则能延缓多酚合成，减轻褐变。,（）培养条件事先对母株或枝条遮光处理后再取材接种，则褐变可以减轻因为在酚类化合物合成和氧化过程中，有一部分酶系统活性是受光诱导的。采用暗培养或弱光照培养能够减轻
31、褐变。较高的培养温度能加速培养物的褐变例如，卡特兰在2530下培养，褐变物质渗出量大，而1520下的渗出量小。,（）每代的培养时间代期过长，加剧褐变的发生。培养基对培养物的营养供给可能跟不上，有害物质（代谢垃圾）则可能越积越多，从而促进细胞的衰老甚至死亡,、防止褐变的措施（）选择适当的外植体（）母株和外植体的预处理（）在培养基中添加抗氧化剂、防褐变剂或解毒剂（）培养方式和培养条件,（）选择适当的外植体选择褐变不严重、具有较强分生能力的外植体，使外植体保持旺盛的生长状态。顺利地实现细胞的脱分化和再分化，就能够最大限度地减轻褐变的发生。,（）母株和外植体的预处理母株遮光或将母株栽植于温室内外植体的
32、预处理方式如低温处理（5）、饥饿处理和热处理等但最多用的是药剂处理即在抗氧化剂或防褐变剂溶液中进行外植体切割、浸泡处理或预培养等，既减少伤口与氧的结合，又可抑制伤口附近组织的褐变反应，阻止褐变的发展,（）在培养基中添加抗氧化剂、防褐变剂或解毒剂通常使用的药剂有抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇、聚乙烯吡咯烷酮（即PVP，有可溶和不溶两种）、牛血清蛋白、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫脲、巯基乙醇、二乙基二硫代氨基甲酸钠（即DIECA，俗称铜试剂）和氰化钾等,这些药剂的防褐变机理有多个方面包括吸收或吸附酚类底物（如PVP）抑制多酚氧化酶活性（如DIECA）影响底物与酶的结合（如巯基乙醇）与酚类底物
33、竞争活性氧抑制酶促褐变（如抗坏血酸）创造酸性条件抑制酶促褐变（如柠檬酸）等，可酌情选用。,活性炭在离体培养中应用较多作为一种强效的解毒剂，能够吸收已生成的褐变物质，降低其在外植体周围的浓度但活性炭同时也会吸收生长激素等活性物质，降低其有效浓度,（）培养方式和培养条件采用液体培养，外植体分泌的褐变物质能够很快扩散开来对于悬浮培养而言，还可以通过不断添加或更换新鲜培养基，把褐变物质的浓度不断稀释,对于固体培养，缩短继代周期减少褐变物质在外植体附近的积累此外，在比较理想的培养条件下（包括光照、温度、氧分压）进行培养，也会使褐变得到不同程度的遏制。,第四节培养基及其配制,一、培养基的种类及组成有数十种
34、之多；分类：1）固体培养基和液体培养基；2）基本培养基和完全培养基,基本培养基只含有无机营养物（包括大量元素和微量元素）、维生素、氨基酸、碳水化合物和水。完全培养基在基本培养基的基础上，附加一些物质，如各种植物生长调节剂：BA、ZT、KT、2-iP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等，以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。,基本培养基较常用的仅一二十种如MS，改良MS、MT、White、改良White、Nitsch、Heller、N6、B5、ER、NT、WS等，它们在组份上存在或大或小的差别。,无 机 盐 类,大量
35、元素：培养基的大量元素使用量一般在每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P,K、Ca、Mg、S 它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素 微量元素：微量元素的用量一般低于10-510-7克分子浓度。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co,N通常为硝态氮或铵态氮多以KNO3或Ca(NO3)2、NH4NO3的形式提供，或将硝态氮与铵态氮配合使用为培养物的生长提供营养也是胚胎发生的必需条件铵的含量超过8mmol.L-1时对培养物有毒害作用,P是植物的必需元素之一参与生命活动中核酸及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量的贮存、转化与释放
36、等重要的生理生化过程K是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势；Ca、Mg、S的用量相对少一些，浓度在13mmol.L-1范围内较适宜。,有益元素是指非必需的、但对培养物的生长发育有益的一些元素如硅（Si）、碘（I）、硒（Se）、钴（Co）和钠（Na）等在某些植物的离体培养中常有使用如水稻、盐生植物、C4植物和景天酸代谢植物几乎所有的培养基配方中都含有碘元素。,大多元素以离子态提供 Fe以螯合形式(如Fe-EDTA)供给少部分的氮素由有机氮供给,有 机 成 分,糖 维生素 肌醇 氨基酸 其它离体培养物，光合作用能力低，需要碳水化合物作为生长发育的能源包括糖、醇类物质和有机酸糖类最
37、重要作用：提供培养物所需的碳骨架外提供能源可调节渗透压,蔗糖是最好的糖源，其次是葡萄糖和果糖 蔗糖具有热易变(heat-liable)的性质经高压消毒后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，有利于培养物吸收。,维生素类种类很多，与植物体内各种酶的形成有关。通常以B族维生素为主，使用浓度一般为0.110mg.L-1。必不可少的有：盐酸硫胺素（VB1）比较常用的有：烟酸、盐酸吡哆素（VB6）、生物素及VC和VB12VB1用量在0.1-1之间,植 物 激 素,生长素,细胞分裂素,其 它,（）生长素类 主要作用：促进细胞伸长和细胞分裂诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力形成愈伤组织促进胚状体的分化试管苗的生
38、根与一定比例的细胞分裂素配合使用时，能诱导不定芽产生。,常用的生长素有2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）NAA（萘乙酸）IBA（吲哚丁酸）IAA（吲哚乙酸）等它们的活性强弱顺序为2,4-DNAAIBAIAA。,几种生长素的比较：IAA是生物合成的激素，见光易降解；且培养物细胞内含有IAA氧化酶，故IAA的使用浓度一般较高。130mg.L-1NAA和2,4-D是人工合成的生长调节剂，性质稳定，不会被酶氧化和降解，使用浓度一般以0.12mg.L-1为宜。NAA常有利于单子叶植物的分化,2,4-D兼具生长素和细胞分裂素的功能。只用2,4-D就能成功地诱导愈伤组织若配以少量的细胞分裂素则效果会更好。低
39、浓度的2,4-D往往有利于胚状体的发生，2,4-D抑制芽的形成，故在诱导再分化时很少使用。IBA诱导生根的效果较好,（）细胞分裂素类常用的细胞分裂素有激动素（KT）6-卞基腺嘌呤（6-BA）玉米素（ZT）2-异戊烯腺嘌呤（2-iP）腺嘌呤（AD）二苯脲吡效隆（4PU，CPPU）噻重氮苯基脲（TDZ，又名苯基噻二唑基脲）,它们的主要作用：促进细胞分裂与扩大；诱导芽的分化，促进侧芽的萌发与生长；增强蛋白质的合成，抑制衰老；能够改变其它激素的作用。就发挥同一生理效应的浓度来看，其活性的强弱顺序为：TDZ，4PUZT2-iP6-BAKTAD。,但在离体培养中最常用的分裂素是性质稳定、价格适中的6-BA
40、和KT，使用浓度为10-610-7mol.L-1。腺嘌呤因活性弱，使用浓度高。,（）赤霉素类离体培养中使用的赤霉素一般是赤霉酸（GA3），也是一种天然产物，溶于甲醇、乙醇或碳酸氢钠溶液，故用乙醇溶解和保存。,赤霉素的主要作用：诱导茎的细胞伸长，对根的细胞则无效；对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用，即IAA/GA比值高有利于木质部分化，比值低则利于韧皮部分化；可以代替低温和长日照，使一些两年生植物在当年就开花，加快发育进程，具有打破休眠、促进休眠种子和器官萌发的作用；此外，赤霉素还对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用。,（）脱落酸（ABA）除特殊的研究外，植物离体培养中一般不使用脱
41、落酸，（）乙烯及其它生长抑制剂）,水,离体培养中，水既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，它占培养基成分的95。根据培养类型及其研究层次不同，可选择使用不同处理级别的水。如原生质体培养、细胞培养以及分生组织培养一般应使用双蒸水或超纯水，以免水中残留的离子造成培养基成分的变化而影响培养效果。如果是大批量的快速繁殖培养，则可使用一般蒸馏水或纯净水以降低生产成本，提高生产效益。,实验室存放各类试验用水的容器应使用塑料制品，不能使用金属容器。存放容器应定期清洗，避免青苔和微生物滋生。玻璃容器亦不适于存放蒸馏水或纯净水，因为良好的透光性常常极易使青苔生长。,其它附加成分,琼脂 活性炭 附加
42、复合成分,（1）琼脂或卡拉胶 琼脂是从红藻等海藻中提取的一种高分子碳水化合物主要作用：使培养基在常温下凝固不参与代谢、不提供营养首选的固化剂。,琼脂的用量：410g.L-1 增加琼脂可克服“玻璃化现象”。凝固力下降的因素长时间的高温过酸高温存放时间过久,（2）活性炭（AC）及硝酸银活性炭的作用：利用其吸附能力，降低分泌物的毒害作用，使培养基变黑，有利于植物生根有利于形态发生和器官形成可以促进花药培养时的雄核发育，有利于形成单倍体植株；悬浮培养的胡萝卜细胞失去胚状体发生能力后，添加14%的活性炭可恢复其胚胎发生能力。,活性炭使用浓度不宜过高，一般在0.021.0%，多用0.10.5%。活性炭的吸
43、附能力还与温度有关，低温下吸附能力强，高温下吸附能力减弱，甚至解吸附。活性炭会削弱琼脂的凝固能力需提高琼脂用量，凝固之前摇匀。,AgNO3促进愈伤组织分化器官或胚状体能使某些原来再生困难的物种再生植株Ag+能起到抑制乙烯活性的作用，而乙烯抑制细胞分裂，从而克服试管苗玻璃化、早衰及落叶使用浓度：110mg.L-1使用前过滤灭菌，避光保存(见光分解)培养基长期含AgNO3，会导致植株畸形,（4）抗生素的利用 处理内生菌甲基托布津、多菌灵、百菌清效果好链霉素、青霉素、地霉素、新霉素、夹竹桃霉素、抗菌肽也可酌情试用。,常用培养基配方,常用培养基配方：MS（Murashing and Skoog,196
44、2）White（White,1934）B5(Gambor et al,1968)N6(朱至青，1974),二、几类常用培养基的特性,1、高盐型培养基 MS、LS、RM、BL，BM，ER和MT 其特点：无机盐浓度高，养分齐全，铵态氮和硝态氮含量高，比例也比较适合，不需要添加更多的有机附加物，离子平衡情况较好，使用的误差较小。利于愈伤组织的诱导和增殖，能满足植 物组织对矿质营养的要求，适用于高需 肥量植物种类或生长迅速的培养材料。,2、高KNO3型培养基 B5和N6喜钾、喜硝或忌铵的外植体材料适用B5的特点是铵盐较低，盐酸硫胺素较高，对枇杷胚状体的诱导效果较佳。N6由我国的朱至清等发明，高硝酸铵，
45、不含钼，特别适用于禾谷类作物的花药培养，曾获国家发明二等奖，在国内外都有广泛的使用。,3、中盐型培养基包括H（1967），Nitsch（1969）和Miller（1963）等也有广泛的应用。,4、低盐型培养基 特点是无机盐浓度低，适用于生根培养、成熟胚胎培养或种质材料的保存包括White（1943），改良White（1963），HB（1963），WS（1966）和Knop（1965）等其中Knop（1965）仅包括4种成分，可用作水培的培养液，改良White（1963）则比较多用于木本植物。,三、培养基的配制,大量元素配制成10-20的母液 微量元素配制成100-200的母液 激素单独配制成m
46、g/ml的母液 配制培养基时按需要按比例加入水最好是蒸馏水或双蒸水尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂,1、MS母液（stock solution）配制及保存配制各单成分的母液，配成10X、100X、1000X；配制培养基的母液：大量、微量、有机、Fe盐 混合各单成分时注意防止产生沉淀 注意配制各种激素时需要预溶解；,植物生长调节物质通常用mg.mL-1较方便，一般宜配制成0.5或-1的母液,酸类物质（如生长素类和脱落酸）和苯基脲类物质可用极少量的1mol.L-1 NaOH溶解，蒸馏水定容，碱类物质（如腺嘌呤的衍生物细胞分裂素）可用数滴1mol.L-1的HCl或NaOH溶解（用NaOH溶解性更好
47、），蒸馏水定容，GA3用95酒精溶解及定容，玉米素可先溶于少量95酒精中再加水定容。另外，IAA，IBA、NAA和2,4-D也可用95 酒精溶解，蒸馏水定容。冰箱内避光保存 贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。,2、培养基的煮制 琼脂完全溶化后定容 3、pH值的调整过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响；培养基的pH值还影响琼脂的凝固，l mol.L-1的NaOH和HCl调节。一般将培养基的pH值调节到5.46.0。高于6.0，培养基会变硬低于5.0，则不能很好地凝固。,4、培养基的分装与灭菌 要趁热分装一般以占试管、三角瓶等培养容器的1/51/4为宜。太多会浪费培养基
48、，减少生长空间；太少则限制生长。最好把试管斜置，将培养基制成斜面,立即进行高压灭菌处理 在压力表读数为1.1 kgf.cm-2或0.1Mpa，121下保持1520min即可 对于吲哚乙酸、玉米素及某些维生素和抗生素等遇热不稳定的生物活性物质，应用过滤方法灭菌 当培养基温度下降到大约4050（感觉不烫手）时，再加入。,5、培养基的保存与使用培养基凝固后，培养室中预培养23d再用。暂时不用应置于10下，如含有激素，在45低温下保存更佳。一般1个月内用完含IAA或GA，应在1周内用完，以免变质,外植体灭菌后应及时接种培养,培养条件控制,光照,温度,pH,气体,第五节培养条件的影响,湿度,光照包括：时
49、间、强度和光质；光照时间影响植株再生状态；光照强度因植物类型不同而异；光质研究报道较少,一、光照,不同材料对光强的要求可能不同，有的适于光培养，有的适于暗培养，如荷兰芹离体培养中器官的发生不需要光；而黑穗醋栗则相反，光照可显著提高幼苗的增殖率。,同种材料在光照或黑暗条件下产生不同的培养反应如百合原球茎在黑暗条件下，产生小球茎，在光照条件下，产生叶片；一些蕨类植物的茎尖培养在黑暗条件下长根在光照条件下则长叶。在愈伤组织诱导方面暗培养的效果通常优于光培养而且所诱导愈伤组织的质地、颜色也与光培养的有不同。,培养的植物材料对光照强度的要求不是十分严格，每日1216小时、5001000 lx(勒克司)的
50、光照可满足大多数培养物生长和分化的需要。在芽苗生长过程中，尤其是在试管苗生长的后期，应将光照强度提高到30005000lx甚至10000lx以促使小苗从“异养”向“自养”转化，有利于提高移苗成活率。,光质也可以影响外植体愈伤组织的诱导、组织的增殖及其器官分化。据报道，红光能促进杨树愈伤组织的生长，蓝光则有阻碍作用。光周期对培养材料的增殖和分化也有一定的影响。有人发现非洲菊的增殖随光照时间的延长而加快，但超过16h又无作用；在石刁柏的茎尖培养中，根和茎的分化需要每天16h的1000lx照度的光照，而菊芋块茎培养中，每天12h光照有利于根的形成；,二、温度,离体培养中培养材料对温度的要求比光照更为
