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1、第34章 DNA的复制和修复（DNA Replication and Repair）,内 容,DNA的复制DNA的损伤和修复DNA的突变,DNA是生物遗传的主要物质基础，生物机体的遗传信息以密码的形式编码在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。,蛋白质,DNA,RNA,第一节 DNA的复制,DNA的复制：是指以原来DNA分子为模板合成出相同分子的过程。一、DNA的半保留复制 DNA在复制时，两条链解
2、开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制(semi conservative replication)。,半保留复制的实验证明,1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。实验步骤：.大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长12代。.再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中 培养。.裂解细胞。.将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离 心。.在紫外光下可以看
3、到形成的区带。,二、DNA复制的起点和方式,复制子:DNA复制从起点开始直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。复制起点:DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Origin of replication)，用ori表示。复制叉:DNA复制的生长点形状如同分叉故称为复制叉(replication fork)。,原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子。实验表明，它们都在一个固定的起点开始复制，复制叉移动方向大多是双向的，即形成两个复制叉或生长点，分别向两侧进行复制；也有的是单向的，只形成一个复
4、制叉或生长点,用遗传学和生物化学的方法可以确定大肠杆菌染色体DNA的复制起点在基因图谱上的位置。,大肠杆菌复制起点和终点在基因图谱上的位置,Evidence points to bidirectional replication,三、DNA聚合反应有关的酶,反应式：n1dATP DNA polE dAMP n2dGTP+DNA dGMP n3dCTP Mg2+dCMP n4dTTP dTMP,DNA,1DNA的聚合反应和聚合酶 1956年，Kornberg在大肠杆菌提取液中发现DNA聚合酶，以后陆续在不同生物中找到。,+(n1+n2+n3+n4)PPi,DNA聚合酶的反应特点：以四种脱氧核苷酸
5、三磷酸(dNTP)为底物;反应需要模板的指导;反应需要有引物3-OH存在;DNA链的生长方向是53产物DNA的性质与模板相同。,DNA聚合酶催化的链延长反应,由DNA聚合酶催化的DNA合成反应,ABCD,模板-引物 产物,2.大肠杆菌DNA聚合酶,大肠杆菌共有5种不同的DNA聚合酶：DNA聚合酶，II，III，IV，V。,DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol),理化性质：纯化的DNA pol由一条多肽链组成，多肽链中含有一个锌原子。酶分子空间结构近似球体。DNA pol约含1000个氨基酸残基，MW为103KD。经蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段：大片段（Klenow片
6、段）有聚合酶和35外切酶活性，小片段有53外切酶活性。,53外切酶活性,35外切酶活性,聚合酶,N,C,Klenow片段(MW68 kD),小片段(MW35 kD),蛋白酶,功能：聚合功能:通过核苷酸聚合反应使DNA链沿53方向延长。在引物DNA或RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸加上去，就是DNA pol的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。,35外切酶活性校对作用:这种酶活性的主要功能是从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸（对单链作用）。,53外切酶活性就是从53方向水解DNA生
7、长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。每次能切除10个核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用（切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体）。对冈崎片段5末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。,53外切酶活性切除修复作用:,焦磷酸解作用:DNApol的这种活性可以催化3末端焦磷酸解DNA分子。,焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。,这两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。,DNA聚合酶（DNA polII),DNA聚合酶缺陷的突变株
8、仍能生存，这表明DNA pol不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApol。此酶为多亚基，MW 88KD，每个细胞内约有100个酶分子。,催化特性：53聚合酶活力:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。35外切酶活性，但无53外切酶活性。该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。,DNA聚合酶组成：DNA pol 全酶是由多种亚基组成的蛋白质，而且容易分解。现在认为它是大肠杆菌细胞内真正负责从新合成DNA的复制酶。,DNA聚合酶异二聚体,
9、功能A聚合:以模板作指导，以四种脱氧核糖核苷酸作为底物，并且需要有3 的引物链存在，通过核苷酸聚合反应使DNA链沿53方向延长。催化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶和I的15倍和30倍。B 35外切酶活性,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用合成速度（核苷酸/分）持续合成能力,DNA聚合酶,103,000400+1,000-1,2003-200,88,000100+-2,4001,500,830,00010-20+-15,000-60,000500,000,比较项目,DNA聚合酶III
10、,切除引物修复,修复,复制,功能,聚合酶IV 和V:1999年发现,它们涉及DNA的错误倾向修复(error prone repair）,DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上切口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的5-OH生成磷酸二酯键。这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶催化聚合，填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的切口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。,3.DNA连接
11、酶(DNA ligase),连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,切口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,四、DNA的半不连续复制冈崎片段：1968年，冈崎等用3H脱氧胸苷标记T4噬菌体感染的大肠杆菌，然后通过碱性密度梯度离心法分离标记的DNA产物，发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着出现较大的分子。最初出现的DNA片段长度约为1000个核苷酸左右，称为冈
12、崎片段（Okzaki fragment）。,复制叉的移动方向,3,5,3,5,复制的起始,DNA链的延长,DNA链终止,RNA引物的合成：以DNA为模板，NTP为原料，在引物合成酶催化下，合成10-几十个核苷酸。为什么？这是保证DNA聚合过程高度精确的又一措施。已知DNA 聚合酶具有35外切酶功能校对复制过程中的核苷酸，也就是说聚合酶在开始形成一个新的磷酸二酯键前，总是检查前一个碱基是否正确，它不能从头开始合成。因此先合成一条低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来表示是“暂时”的，当DNA聚合以后再将其切除，以高忠实性的脱氧核苷酸取而代之，确保复制的忠实性。,核酸的拓扑结构是指
13、核酸分子的空间结构。两条互相缠绕的双螺旋核酸分子表现出许多拓扑学的关系。在DNA的复制、重组、转录和组装等过程中无不牵涉到其拓扑结构的转变。拓扑异构酶（topoisomerase)：DNA在复制过程中双链需要解开。能引起DNA拓扑异构反应的酶为拓扑异构酶。DNA拓扑酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。,五、复制中的拓扑学问题,DNA拓扑异构酶有两类：类型的酶拓扑异构酶，能使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，可减少负超螺旋。类型的酶拓扑异构酶（旋转酶），能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由ATP供给能量，可引入负超螺旋，它们协同作用控制着DNA
14、的负超螺旋水平。,原核细胞拓扑构酶的作用机制：酶与DNA结合使双链解旋;使一条链切开，但酶与切口的两端结合阻止了螺旋的旋转;酶使另一条链经过切口，然后再将两断端连接起来;酶从DNA上脱落，两条链复原，得到的DNA比原来少一个负性超螺旋。拓扑构酶II的作用机制：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，引入负超螺旋，可以消除复制叉前进时带来的扭曲张力，从而促进双链的解开。,真核生物拓扑构酶 拓扑构酶I：消除正、负超螺旋类型I 拓扑构酶III：消除负超螺旋,拓扑构酶IIa：消除正、负超螺旋，不能引类型II 拓扑构酶IIb：消除正、负超螺旋,入负超螺旋,入负超螺旋,大肠杆菌旋转酶（gyrase)又称为
15、拓扑构酶II，反应需ATP提供能量，可连续引入负超螺旋，可消除复制叉前进时产生的扭曲张力。,将DNA两条链解开，有赖于DNA解螺旋酶，这类酶通过水解ATP获得能量来解开双链，分解ATP的活力要有单链DNA的存在。如双链DNA中有单链末端或缺口，解螺旋酶即可结合于单链部分，然后向双链方向移动。大肠杆菌解螺旋酶、和可以沿模板链的53方向随着复制叉的前进而移动，而rep蛋白则在另一条模板链上沿35方向移动。这两种解螺旋酶的配合作用推动着DNA双链的解开。单链结合蛋白(SSB)：可阻止复性和保护解开的单链。,DNA解螺旋酶(DnaB),六、DNA复制的过程,分三个阶段：起始延伸终止,大肠杆菌复制起点成
16、串排列的重复序列,1.复制的起始,大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型,DnaA,大肠杆菌结合在复制起点的蛋白质,DNA复制的调节,DNA复制的调节的调节在起始阶段，一旦开始就一直到完DNA复制的起始与DNA的甲基化和细菌脂膜的相互作用有关oriC 位点的回文序列GATC（11个）的甲基化新合成链的甲基化滞后13 min,A replisome consists of:DNA gyrase,the priming complex(primosome,helicase,primase,primer),SSB,and DNA polymerase III holoenzyme,2.复制的延伸
17、,聚合酶III核心酶,聚合酶I,聚合酶III核心酶,滞后链,前导链,解螺旋酶,引物合成酶(DnaG),RNA引物,引发体,拓扑异构酶II,-夹子,-聚体,-夹子,-复合物,RNA引物,单链结合蛋白（SSB）,3.复制的终止,复制叉2,复制叉1,终止复制叉2,终止复制叉1,复制叉1,复制叉2,完成复制,DNA拓扑异构酶IV,连锁染色体,修复复制,22 bp,Tus,Tusterminus utilization substance,七、真核生物DNA的复制,起点复制：称作自体复制顺序（autonomously replicating sequence,ARS）或复制基因（replicator）。
18、酵母ARS约有150个bp，含有几个保守序列，这表明在真核生物DNA中有多个复制的起点。真核生物DNA的复制的起始还需要一个原点识别复合物（ORC），受控制真核生物细胞周期的蛋白质的调控。,1.多个起点复制,冈崎片段：100-200个核甘酸,2.存在复制叉 真核生物DNA复制过程中也出现复制叉，而复制叉的移动速度较原核生物慢，仅为原核生物的1/20，（约50nt/秒）。3.DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有：a、b、g、d、e DNA聚合酶：负责染色体DNA的复制。该酶大亚基负责聚合，小亚基负责引物的合成，由于缺乏3-5的外切活性，可能参与滞后链RNA引物的合成。DNA聚合酶：负责DNA链的
19、延伸，完成复制。该酶需要增殖细胞核抗原（PCNA）来协助，,其主要功能类似于原核生物DNA聚合酶的亚基，形成一个环行的加子，增加DNA聚合酶复制的连续性。DNA聚合酶：主要负责核DNA的修复。DNA聚合酶：参与冈崎片段的修补。DNA聚合酶：负责线粒体DNA的复制。,哺乳动物的DNA聚合酶,DNA聚合酶(M),亚基数细胞内分布外切酶活性引物合成酶活性持续合成能力抑制剂功能,DNA聚合酶(I),4个细胞核无有中等蚜肠霉素引物合成,2个线粒体3-5外切酶无高双脱氧TTP线粒体DNA合成,2个细胞核3-5外切酶无有PCNA时高蚜肠霉素核DNA合成,DNA聚合酶(III),DNA聚合酶(IV),1个细胞
20、核无无低双脱氧TTP修复,DNA聚合酶 e(II),1个细胞核3-5外切酶无高蚜肠霉素修复,细菌和真核生物复制体的组成,组成 细菌 真核生物,复制酶 DNA聚合酶III 全酶 DNA聚合酶a/d,进行性因子 b夹子 PCNA,定位因子 g复合物 RFC,引物合成酶 DnaG DNA聚合酶a,去除引物 DNA聚合酶I和RNase H RNase H1 和MF（5 3 外切酶）,滞后链修复 DNA聚合酶I和 DNA连接酶 DNA聚合酶e和 DNA连接酶I,解螺旋酶 DnaB T抗原,消除拓扑张力 旋转酶 拓扑异构酶II抗原,单链结合 SSB RPA,八、端粒酶（telomerase）,DNA复制时
21、，由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA链的最后一个引物去除引物后，无法填补空隙，易造成子代DNA链的缩短。,这一难题是通过端粒（telomere)和端粒酶(telomerase)的发现才得到了澄清。真核线性DNA的末端形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒,有许多成串的重复序列，一条链富含G，另一条链富含C，如人的端粒为：TTAGGG。端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生
22、殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒合成的一种模型,第二节 DNA的损伤与修复,DNA复制过程中可能发生错配，DNA的重组，病毒基因的整合，常常会破坏局部DNA的双螺旋结构。某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都能作用于DNA,造成结构的破坏，引起生物突变，甚至致死的作用，称为DNA的损伤。细胞对DNA损伤的修复主要有以下5种类型:,错配修复(mismatch repair)直接修复(direct repair)切除修复(excision repair)重组修复(recombination repair)易错修复(error-pr
23、one repair),一错配修复 错配修复依赖模板链提供的信息。因此、生物体必须有一个区分模板链和新合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方式来为模板链加上标签。甲基化位置在GATC序列的A上。,Mut基因产物参与错配修复,5,3,ExoVII or RecJ,ExoVII or RecJ,1、形成嘧啶二聚体,2、光复活酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,二、直接修复,三、切除修复,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,切开,切除,修复,连接,N-糖苷酶,(UvrABC),四、重组修复,重组,复制,修复,五
24、、应急反应（SOS）和易错修复,许多造成DNA损伤或抑制修复的处理均能引起一系列复杂的诱导反应，称为应急反应（SOS response)。SOS反应包括：DNA损伤或抑制修复 诱变效用 细胞分裂抑制等,SOS诱导的修复反应包括：避免错误的修复（error free repair)易错修复(error-prone repair),未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),六、与DNA修复有关的人类遗传疾病,着色性干皮病 是一种隐性遗传性疾病，有些呈性联遗传。因核酸内切
25、酶（与切除修复有关的酶）异常造成DNA修复障碍所致。临床以光暴露部位色素增加和角化及癌变为特征。幼年发病，常有家族发病史。多数患者于20岁前因恶性肿瘤而死亡。,2.遗传性大肠癌、结肠癌的临床特征,错配修复相关基因的改变:MSH2,MSH6,PMS1，MLH1,MSH3,PMS2.,3.与重组修复相关基因的改变 Brca 1、Brca 2 80%几率患乳腺癌,第三节 DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之
26、间的交换而引起的遗传重组。,一、突变的类型碱基对的置换(substitution)移码突变(frameshift mutation),碱基替换：一个碱基对被另一碱基对替换。包括:转换(transtion)颠换(transversion)。,移码突变：增加或减少一个或几个碱基对。,DNA突变的类型,-T-C-G-C-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-G-A-C-A-T-G-C-,转换,野生型基因,-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-,-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-,颠换,碱
27、基对的置换(substitution),移码突变(frameshift mutation),-T-C-G-C-A-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-T-G-A-C-A-T-G-C-,插入,-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-,缺失,T,A,二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog)碱基修饰剂(base modifier)嵌入染料(intercalation dye)紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation),酮式BU-A烯醇式BU-G,5-溴尿嘧啶(5-bromouracil,BU):是
28、胸腺嘧啶的结构类似物。,1.碱基类似物,A,T,A,T,A,BU,G,BU,A,T,A,BU,G,C,G,C,G,BU,A,BU,A,BU,G,C,G,C,A,T,酮式 烯醇式,烯醇式 酮式,2-氨基嘌呤(2-aminopurine):可取代腺嘌呤与T配对亚氨状态时可与胞嘧啶配对,A,T,AP,T,A,T,A,T,AP,C,G,C,AP,T,2.碱基的修饰剂,亚硝酸(nitrous acid,HNO2)：具有氧化脱氨作用。,A,I,HNO2,C,U,HNO2,G,HNO2,X(ok),发生碱基转换,烷化剂,烷化剂是目前应用最广泛而有效的诱变剂。最常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基磺酸甲酯(M
29、MS)、亚硝酸胍等。它们都带有一个或多个活泼的烷基，这些烷基能够移到其他电子密度较高的分子中去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而多方面改变氢键的结合能力。,烷化作用主要发生在碱基的N1、N3、N7位置上。最容易发生在G的N7位置上，形成7-烷基鸟嘌呤。7-烷基鸟嘌呤可与胸腺嘧啶配对，从而产生GCAT的转换。,烷化作用可使DNA的碱基容易受到水解而从DNA上裂解下来，造成碱基的缺失。从而引起碱基的转换与颠换及移码突变。,3.嵌入染料,包括原黄素(proflavin)、吖啶橙（acridine orange）、溴乙啶（EtBr）等。它们通过插入到DNA双螺旋双链或单链的两个相邻的碱基之间，起到插入诱变的作用，这种突变往往是移码突变。,TACGA ATCGGGTATT,ATGCT TAGCCCATAA,TACGA ATCGGGTATT,ATGCT TAGCCCATAA,CG,染料分子嵌入,复制,插入一个碱基对,移码突变,4.紫外线(ultraviolet)和电离辐射,紫外线（ultraviolet light，UV）：能使DNA产生两种光生成物环丁烷嘧啶光二聚体和6-4光生成物（嘧啶6位碳与相邻嘧啶4位碳原子间结合）。电离辐射作用复杂，可产生DNA单双链断裂、碱基迫坏等。,
