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1、第九章 DNA序列分析,第一节 Maxam-Gilbert化学降解法第二节 Sanger链终止法第三节 DNA片段序列测定的策略第四节 核苷酸序列的生物信息分析,第一节 Maxam-Gilbert化学降解法,化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。,第二节 Sanger链终止法,1977年Sanger设
2、计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。Sanger法获得诺贝尔化学奖。一、Sanger双脱氧链终止法原理在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。,二、双脱氧
3、终止法测序反应体系：,DNA聚合酶单链DNA模板带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(aATP、dGTP、dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP),Sanger法DNA测序的试剂 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 模板 DNA聚合酶 2,3-双脱氧核苷三磷酸（2,3-dideoxynucleoside triphosphate,ddNTP）dNTP三、测序反应的种类 引物标记法(Dye primer reactions)终止物标记法(Dye ter
4、minator reactions),This figure shows the structure of a dideoxynucleotide(notice the H atom attached to the 3 carbon).Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction.Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction.,This figure is a representation of a
5、n acrylamide sequencing gel.Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand,5 to 3,is AATCTGGGCTACTCGGGCGT,测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT四个试管中所有产物是
6、一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳：ACGT次序，高压电泳4.放射自显影得到直读图象,第三节 DNA片段序列测定的策略,人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方 法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高，大大推进了大规模DNA测序的进程。一、定向测序策略 定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。,二、随机测序战略 随
7、机测序战略又称鸟枪战略(shotgun strategy)，此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建 立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。三、多路测序战略 多路测序战略(Multiplex method)是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅 读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆进行测序。,四、大规模DNA测序的趋势自动化,DN
8、A测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前，DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克隆群顺序排定等过程 均已平行发展，自动化操作紧随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装起来，以实现DNA测序的完整性。目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。,1、克隆筛选从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。2、模板制备 现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。特定用途的DNA分离仪也已采用。3、测序反应由于手工测序不能
9、保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以，DNA测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。4、自动放射性自显影阅读机近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。5、自动测序仪DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。,310型全自动遗传分析仪,DNA全自动分析仪：,ABI Prism 3100遗传分析仪,3700型全自动遗传分析仪,安玛西亚DNA序列分析系统型号：MegaBACE 500/1000/4000,分析仪器的新发展：,377型遗传分析仪 3730型遗传分析仪,377型DNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结
10、合美国应用生物系统(ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，一个泳道检测的方法，一个测序反应保证500bp的准确序列。3730型DNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效果更好，通量更大，一个测序反应保证800bp的准确序列，是当前基因测序的主打。,优点：i.四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；ii.可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。,DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片
11、过程”的自动化。,西南大学生物技术专业 基因工程,25,一、在线分析的核心网站http:/http:/au.expasy.org/tools/#primary二、本地分析的重要软件Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。DNA Star：综合分析Primer Premier 5.0：引物设计Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算GCG：蛋白质、核酸序列,第四节 核苷酸序列的生物信息分析,西南大学生物技术专业 基因工程,26,三、Genbank序列检索,西南大学生物技术专业 基因工程,27,西南大学生物技术专业 基因工程,28,西南大学生物技术专业 基因工程,2
12、9,西南大学生物技术专业 基因工程,30,四、DNA、RNA和蛋白序列序列创建分子分析,西南大学生物技术专业 基因工程,31,西南大学生物技术专业 基因工程,32,五、序列多重比对,西南大学生物技术专业 基因工程,33,西南大学生物技术专业 基因工程,34,六、引物设计,西南大学生物技术专业 基因工程,35,七、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool):Genbank同源性搜索,西南大学生物技术专业 基因工程,36,西南大学生物技术专业 基因工程,37,西南大学生物技术专业 基因工程,38,西南大学生物技术专业 基因工程,39,西南大学生物技术专业 基因工程,40,西南大学生物技术专业 基因工程,41,八、DNA和蛋白结构预测,西南大学生物技术专业 基因工程,42,西南大学生物技术专业 基因工程,43,西南大学生物技术专业 基因工程,44,
