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1、分子克隆实验原理,分子克隆实验原理,一、菌种保存和活化二、质粒提取和保存三、感受态细胞的制备四、载体的制备五、基因的制备六、连接七、转化八、重组克隆的筛选,菌种保存和活化,一.甘油菌保存：1、100 ul菌液100 ul灭菌甘油【混匀】2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】3、20 可保存半年；【80 可长期保存】二、甘油菌活化：1、取一管甘油菌，混匀；2、用接种针接种并在培养平板上划线；3、37 倒置培养12 h；4、挑单克隆于2.5ml LB(视情况加抗生素），37 振荡培养12 h.【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】,质粒的提取原理碱裂解法,三种溶液：溶液1：50
2、m mol/l 葡萄糖-维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25 m mol/l Tri Cl（pH 8.0)-维持 pH;10 m mol/l EDTA(pH 8.0)-螯合Ca2+,DNase 失活，保护DNA溶液2：0.2 mol/NaOH-核酸变性（pH12或pH3)(解链）1%SDS-蛋白变性，裂解细胞。溶液3：7.5 mol/L NH4AC（pH 7.6)-沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。其它溶液：（1）2M NH4AC-沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-沉淀质粒（3）70乙醇-沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。(4)RNase-除去细菌RNA,质粒的提取原理
3、碱裂解法,Protocal:1.5 ml 菌液，12000 rpm*1 min,弃上清（repeat)收集细菌 溶液1(200 ul),剧烈混匀提供缓冲液溶液2(400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;裂解细胞，蛋白核酸变性溶液3(300 ul),温柔混匀，冰中10 min;质粒复性13000 rpm*5 min,取上清；除去细菌蛋白，基因DNA540 ul 异丙醇，室温 10 min;沉淀质粒14000 rpm*10 min,弃上清；除去可溶性杂质100 ul 2M NH4AC13000 rpm*5 min,取上清；100 ul 异丙醇，室温10 min;14000 rpm*10 min,
4、弃上清；70%乙醇500 ul,14000 rpm*10 min,弃上清；除去异丙醇，盐分烘干10-30 min,除去乙醇50 ul ddH2O(含0.1 mg/ml RNase),37C*30 min.除去细菌RNA电泳鉴定,初抽,精抽,除去少量杂质蛋白,质粒的保存,1.ddH2O(可含EDTA)中可短期保存 4 保存1月;-20 可保存一年 2.75%乙醇可长期保存.3.烘干可长期保存(可能难溶),感受态细胞的制备,1.菌种活化2.取0.5ml菌液至50ml LB培养液中；3、37，振荡培养2h至对数期；4、转至50 ml无菌塑料管，0*10 min;5、5000 rpm*10 min*4
5、 6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0，无菌】7、5000 rpm*10 min*4 8、取沉淀,加 2 ml 含15甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至80 冰箱保存（半年有效）。【注意：（1）需要做一个无质粒的对照（2）并用已知质粒转化，鉴定感受态细胞的转化效率大约106【1ug PUC 质粒，产生克隆106】,载体的制备,1、酶切（放大体积100 ul，要充分)2、胶回收（注意远紫外照射时间不能太长，防止DNA突变）3、纯度，浓度测定。(电泳测定）,基因的制备(*),1、PCR扩增2.酶切3、胶回收4、纯度，浓度测定,连接,1、总体积为1
6、0 ul；2、16 连接过夜；3、基因mol/载体mol 10;【平端 15】,转化,1、连接产物 5 ul加入感受态细胞中；2、混匀，冰上30min-cell 吸附DNA3、42,90 s热击，促进DNA进入cell4、冰上12min使细胞复原5、加1ml LB(无 Amp)外源DNA还未表达6、37 培养1hAmp抗性基因表达7、6000rpm*30s，浓缩100ul8、涂板（Amp板）抗性筛选9、37 培养过夜。,重组克隆的筛选*,1、抗性筛选；2、蓝白斑筛选；3、酶切电泳筛选(*)；4、PCR筛选；5、测序验证；6、表达筛选；7、生物活性筛选。,抗性筛选-质粒载体携带的筛选标记,1.A
7、mpR（氨苄青霉素抗性）2、TetR(四环素抗性）3、KanR(卡那霉素抗性)特点：一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证外源基因插入。,克隆的Amp抗性筛选,蓝白斑筛选半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应,一、互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性），载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表达）蓝斑；二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行互补白斑。（）三、特点：1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；2、无法确定基因插入的方向；3、特殊：基因过小，
8、且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失活，将产生互补，产生蓝斑。,酶切电泳筛选(*),一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片断的大小。二、特点：1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。2、结果可靠但操作比较麻烦；3、无法检测基因内部的突变。,EcoR1和Xho1双酶切筛选,PCR筛选,1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组质粒。二、特点：1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量检测。2、不能检测基因插入方向3、不能检测基因内部突变。,测序验证,一、选取阳性克隆，送公司测序；二、特点：1、最可靠的检测方法。可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等。2、价格贵，适于12个克隆的验证
9、。,1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格贵）60元左右。2、测定的序列靠近引物（起点）2030bp不准，500bp后的序列也不准。3、（1）质粒测序：测序引物公司提供（2）PCR产物直接测序：测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。注意:A.测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物一般不能测序；B.测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在5060%左右。,测序验证,表达筛选,一、SDS-PAGE筛选；二、亲和筛选；三、免疫筛选；,SDS-PAGE筛选,1、小量诱导表达；2、全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳；3、重组的表达克隆将在特定的位置出
10、现较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照）特点：1、可检测外源基因的表达。（一般基因的插入，方向，读框都正确）2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。,亲和筛选,1.50 ml菌液诱导表达，2、超声破菌，3、用少量亲和beads吸附上清；4、SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。特点：1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；2、比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；3、比较麻烦。,免疫筛选,用抗体检测目标蛋白：Western blot（最准确）ELISA(可能会受到交叉反应的干扰）,生物活性筛选,酶：测定酶活；亲和蛋白：与亲和底物作用。其它的生物活性。,分子克隆流程,1、分析基因，载体特点；2、设计克隆策略；3、检测基因，载体的正确性；4、制备感受态细胞，目的基因，载体；5、连接，转化。6、筛选克隆（1）Amp抗性初筛；（2）PCR筛选（或酶切筛选）；（3）表达筛选（SDS-PAGE和亲和筛选）；（4）测序验证（5）生物活性筛选。,
