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1、动物生物化学Animal Biochemistry,教材：夏未铭 主编动物生物化学杨满军 主讲西藏职业技术学院 畜牧兽医系电子邮箱:majoryang,绪 论,本章主要内容：生物化学的概述 生物化学研究的内容 生物化学的发展历史与现状 与动物生产和动物健康的关系,1.生物化学概述,1.1 生物化学的定义：生物化学（biochemistry）：是从分子水平上阐明生命有机体 化学本质的一门学科。1.2 生物化学的分类：根据研究对象分为：动物生物化学、植物生物化学、微生物生物化学等。根据研究目的分为：医学生化、农业生化、工业生化、环境生化 和营养生化等。,2.生物化学研究内容,2.1 关于生命有机体
2、的化学组成、生物分子，特别是生物大分子（biological macromolecule）的结构、相互关系及其功能。,生物大分子是由小分子单体聚合而成的多聚体。如氨基酸蛋白质、核苷酸核酸、葡萄糖淀粉等。生物大分子执行着各种各样的生物学功能，如生物催化、物质运输、代谢调节、贮存、传递与表达遗传信息等。它们复杂的空间结构是其功能的化学基础。,2.2 细胞中的物质代谢与能量代谢，或称中间代谢（intermediary metabolism），也就是细胞中进行的化学过程,合成代谢（anabolism）：将小分子的前体（precursor）经过特 定的代谢途径构建成较大的分子，并且消 耗能量。分解代谢（
3、catabolism）：将较大的分子经过特定的代谢途径，分解成小的分子并且释放出能量。物质代谢与能量代谢相伴随。在这个过程中，ATP（三磷酸腺苷）是能量转换和传递的中间体。,2.3 组织和器官机能的生物化学,生命有机体是一个统一协调的整体。任何组织器官的形态结构、代谢方式都是以其化学组成和分子结构为基础的。在分子水平、细胞和组织水平以及整体水平上全面、系统地认识动物组织器官的生理机能，认识它们之间的联系、认识它们与环境互作的机制，也是动物生物化学的研究目的之一。,3.生物化学的发展历史和现状,3.1 历史回顾,我国古代对于生物化学的发展有重要的贡献。科学发展的道路不是平坦的，人们对事物的认识在
4、正确与错误，真理与谬误的斗争中前进，生物化学的发展也不例外。Friedrich Wohler，Eduard 和 Hans Buchner 弟兄以及 J.Sumner 等与“生机论（vitalism）”的谬论进行了长期的争论，“生机论”最后以失败告终。,科学的发展也不是单枪匹马的，多学科的互相交叉与渗透、研究技术和实验手段的进步推动和加速了科学进步的步伐。化学、物理学、细胞学、遗传学、微生物学以及电子显微镜、超离心（ultra-centrifugation）、色谱（chromatography）、同位素示踪（isotope tracing）、X-射线衍射（X-ray reflection）、质谱
5、（mass chromatography）以及核磁共振（nuclear magnetic resonance）等技术都为现代生物化学的发展作出了重要贡献。,1953年Watson 和Crick描绘出了DNA的双螺旋结构模型，这在生命科学发展历史上是一个具有里程碑意义的重大事件。生命科学从此进入了分子生物学新时代。,悼念克里克,生物化学与分子生物学都以从分子水平上认识生命、诠释生命为目标。广义地说，两者没有截然的区别。只是前者注重生命有机体的化学过程，后者更强调生物分子的结构与功能，尤其是在遗传分子核酸方面。,3.2 生物化学的前景和现状,目前，有关生物化学的研究主要集中在以下几个方面：生物大分
6、子的结构、功能与相互作用 基因组学和蛋白质组学 基因表达的调节 细胞信号的传导 生物工程学,分子生物学的迅速发展从根本上改变了生命科学的面貌，也极大地丰富和扩展了生物化学的内涵。一方面，经典的生物化学原理不断得到验证，另一方面，人们对生命有机体中化学过程的认识不断更新和深化，现代生物化学的发展已经从各个方面融入了生命科学发展的主流当中。,生物大分子的结构、功能与相互作用,大分子之间的相互作用；大分子结构模体（motif）和结构域的独特作用；生物大分子三维构象和构象运动进行描述；蛋白质空间构象的正确折叠和“分子伴侣”（molecular chaperone）的作用；磷酸化、酰基化等化学修饰作用对
7、于蛋白质和酶在快速、高效传递代谢信息和调节基因表达中的机制；核酸与蛋白质的相互作用与基因表达的调节；催化核酸等。信息爆炸导致了结构生物学（structural biology）的诞生。,蛋白质和核酸大分子之间的相互作用,基因组学和蛋白质组学,“人类基因组计划”（human genome project，HGP）历经10个年头，在进入本世纪后不久宣布完成，人类基因组的解读为疾病的诊断、防治和新药的研究开发提供了有力的武器。科学家已绘制出40余种生物的基因组图谱，基因组的研究将进入功能基因组（functional genomics）阶段，即确定基因结构与功能的应用阶段。蛋白质组学（proteomi
8、cs）作为后基因组时代生命科学新的研究领域正在崛起。它将一系列精细的技术，主要有2D-凝胶电泳、计算机图象分析、质谱、氨基酸测序和生物信息学结合起来，高通量地、综合地定量和鉴定蛋白质。建立蛋白组的生物信息数据库，将为重大病症的发生提供新的预警和诊断标志，并为新药的开发提供新的思路。,大肠杆菌中的蛋白质组,基因表达的调节,1960年，F.Jacob和J.Monod发现细菌利用乳糖时，相关酶的基因表达时序受到严格的控制，于是提出了原核生物基因调节操纵子（operon）模型，开辟了对基因表达调节研究的新领域。真核基因表达的调控产要涉及核小体的重构、组蛋白的乙酰化、DNA的甲基化等化学修饰和DNA超螺
9、旋的拓扑异构化；基因的的调节也在转录后的加工、翻译和新生多肽链的化学修饰等各个层次上进行。这一领域的研究将最终揭开生命的进化、胚胎的分化、个体的生长、发育、繁殖、衰老、疾病和死亡之谜。,细胞信号的传导,第二信使学说 cAMP、cGMP、IP3、DG、Ca2+等 G蛋白偶联系统 G蛋白、PKA、PKG、PKC和TPK信号转导系统等小分子气体物质 NO、CO,生物工程学,到70年代，重组DNA技术（Recombinant DNA technology）诞生，人类可以按照自己的意愿改造遗传基因和操纵遗传过程。这个技术的规模化和工业化，就是基因工程，也称遗传工程（Genetic engineering
10、）。以基因工程技术为核心，与现代发酵工程、细胞工程、胚胎工程、酶工程、蛋白质工程等集合而成的生物工程学（Biotechnology），已经和正在展现出其推动生产力发展的巨大潜力。,遗传工程的工厂,4.与动物生产和健康的关系,生物化学是生物科学，如农学、医学、畜牧、兽医、水产等的基础学科之一。现代生物化学的理论和实验方法已经作为通用的“语言”与有力的“工具”被广泛用于生命科学的表述和研究之中。它与动物生理学、动物营养学、动物遗传学、动物繁殖学、药理学、动物病理学、微生物学、免疫学、动物疾病诊断学等学科有着不可分割的联系，因此学习和掌握生物化学的知识对于从事动物生产和动物健康事业十分重要。,阐明动
11、物新陈代谢活动的规律 生理学、营养学 培养优质高产的畜禽品种 遗传育种 药物的作用机理研究和新药的研发 药理学、毒理学 疾病的发生和发展机理 病理学、免疫学、微生物学 动物疫病的诊疗与防治 临床病理与临床诊断学,教学安排与要求,（1）学时：72学时（2）课外自习（3）辅导与答疑（4）考试方式 闭卷考试,参考书,1.王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学（第三版）.北京：高等教育出版社，20022.汪玉松，邹思湘，张玉静.现代动物生物化学（第三版）.北京：高等教育出版社，20054.DL Nelson，MM Cox.Lehninger Principles of Biochemistry（3rd ed
12、ition）.2000，Worth Publisher5.Berg JM,Tymoczko JL,Stryer L.Biochemistry(4th edition),2002,Freeman,绪论完！,第一章核酸与蛋白化学,BIOCHEMISTRY OFNUCLEIC ACID&PROTEIN,核酸(nucleic acid)是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子,起携带和传递遗传信息的作用。,核酸的分类、分布及功能,脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA):90%以上分布于细胞核，其余分布于线粒体内。储存和携带遗传信息。核糖核酸(ribonucleic acid,R
13、NA):分布于胞核、胞浆中。参与遗传信息的表达。,第一节核酸的化学组成,核酸可在核酸酶的作用下水解。,一、碱基(base)每种核酸的主要碱基都有四种。,碱基结构：,五种碱基上的酮基或氨基，均位于杂环上氮原子的邻位。因此都能形成酮式-烯醇式或氨基-亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。,二、戊糖与核苷戊糖结构：,核苷（ribonucleoside)嘌呤碱N-9或嘧啶碱N-1与核糖或脱氧核糖C-1通过糖苷键相连形成核苷或脱氧核苷。,三、核苷酸（nucleotide）核苷（或脱氧核苷）与磷酸通过酯键，结合构成核苷酸（或脱氧核苷酸）。,体内重要的游离核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸
14、：NMP、NDP、NTP,环化核苷酸：cAMP、cGMP含核苷酸的生物活性物质：NAD+、NADP+、CoASH、FAD等都含有AMP,第二节核酸的结构,核酸的组成,核酸 nucleic acid,核苷酸 nucleotide,核苷 nucleoside,磷酸 phosphate,嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base,（碱基 base）,核糖 ribose 或 脱氧核糖 deoxyribose,（戊糖 amyl sugar）,Nitrogenous base,Pentose sugar,Phosphate,核苷酸,核酸是由核苷酸为基本单位形成的生物大分子,
15、核苷酸之间是如何连接形成核酸分子的？,核酸,核苷酸,？,核酸中核苷酸的连接方式：,酸碱滴定结果显示，核酸分子中的磷酸基只有一级解离，因此它的另外两个酸基必定与糖环的羟基形成了磷酸二酯键。,5,2,3,酶切结果显示，RNA分子中核苷酸之间以3，5磷酸二酯键相互连接；DNA分子中只有3羟基，因此：组成核酸的核苷酸分子是以3，5磷酸二酯键彼此连接的。,牛脾磷酸二酯酶水解5羟基形成的酯键，蛇毒磷酸二酯酶水解3羟基形成的酯键。,核酸共价结构的表示方法：结构式、竖线式、文字式,DNA中多核苷酸链的一个小片段,结构式：,竖线式：,P表示磷酸基。,（碱基）,竖线代表戊糖,文字式:,DNA的结构,一、DNA的一
16、级结构,DNA是由数量极其庞大的4种脱氧核糖核苷酸之间通过3,5-磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。,DNA的分子量非常大，通常一个染色体就是一个DNA分子，最大的染色体DNA可超过108bp，即Mr11011。如此大的分子能编码的信息量是十分巨大的。,补充：DNA与基因,DNA,Transcription,RNA（mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。可以被用做模板产生一种或者多种RNA的蛋白质产物。,结构基因,调节基因,基因组,DNA与基因,原核生物基因组的特点,1.DNA大部分为结构基
17、因，每个基因出现频率低。,2.功能相关基因串联在一起。,3.有基因重叠现象。,1.重复序列,单拷贝序列,：在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。,中度重复序列,：在DNA中可重复几十次到几千次。,高度重复序列,：可重复几百万次,真核生物基因组的特点,2.有断裂基因,mRNA,1 872bp,内含子（intron)：基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。,外显子（exons）：为多肽编码的基因片段。,：由于基因中内含子的存在。,2.3 核酸的分子结构,DNA一级结构,核酸分子中核苷酸的连接方式：3,5-磷酸二酯键,碱基组成分析 Chargaff 规则。,已知核酸化学结
18、构和核苷酸键长与键角的数据。,DNA纤维的X-线衍射图谱分析。,DNA二级结构（双螺旋结构）的研究背景：,二、DNA的二级结构,碱基组成的Chargaff规则的提出依据,DNA的碱基组成具有生物种的特异性，不同物种的DNA有独特的碱基组成。同物种不同组织和器官的DNA碱基组成是一样的，不受生长发育、营养状况及环境条件影响。,Chargaff首先注意到了碱基组成的某些规律性。1946-1950年，他用纸层析和紫外分光光度法测定了不同来源DNA中的碱基摩尔数，总结出了DNA碱基组成规律，称Chargaff规则。,Chargaff规则的要点：,腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即 A=T；鸟嘌呤和胞嘧啶
19、的摩尔数相等，即 G=C；含氨基的碱基（腺嘌呤和胞嘧啶）总数等于含酮基（鸟嘌呤和胸腺嘧啶）总数，即 A+C=G+T；嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即 A+G=C+T。,所有DNA中碱基组成必定是A=T,G=C；这一规律暗示A与T，G与C相互配对的可能性，为Watson和Crick提出DNA双螺旋结构提供了重要依据。,碱基组成分析Chargaff 规则。,已知核酸化学结构和核苷酸键长与键角的数据。,DNA纤维的X-线衍射图谱分析。,DNA二级结构（双螺旋结构）的研究背景：,二、DNA的二级结构,DNA因为DNA分子太大，很难制得晶体。用针从浓的DNA溶液中抽出纤维，可使DNA分子成束整齐排列，即可用
20、于衍射研究。,Watson和Crick将Chargaff规则和DNA的紫外衍射图谱加以研究，并结合已有的DNA相关物理数据测定结果，提出了DNA双螺旋结构模型。,DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构的要点,1.DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链的方向为3端5端。,2.嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面
21、与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,3.螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。,4.维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律：A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。,DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等,5.螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。,6.
22、氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,双螺旋结构模型要点(B-DNA),1.反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧.,2.碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴.,3.右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈.,4.表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础.,5.维持结构稳定的力：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定.,Watson和Crick所建议的结构代表DNA钠盐在较高湿度(92%)制得纤维的结构B型(B form)。由于它的水分含量较高，可能比较接近大部分
23、DNA在细胞中的构象。除B型外，还有A型、C型、D型、E型和左手螺旋Z型。,DNA双螺旋的不同构型,B-DNA螺旋：标准的Watson-Crick双螺旋，细胞正常状态下DNA存在的构型(92%相对湿度钠盐中)。A-DNA螺旋：DNA在75%相对湿度的钠盐中的构型。C-DNA螺旋：DNA在66%相对湿度的锂盐中的构型。Z-DNA螺旋：左手的DNA螺旋，这种螺旋可能在基因表达或遗传重组中起作用。,Z-DNA：左手螺旋，外形细长。天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA。,B-DNA：右手双螺旋每圈螺旋10.4个碱基对螺距：3.32nm,A-DNA：右手双螺旋，外形粗短。RNA-RNA、RNA-D
24、NA杂交分子具有这种结构。,Z-DNA,A-DNA,B-DNA,DNA的双螺旋结构被发现后不久研究者就观察到人工合成的寡聚核苷酸能形成三股螺旋。,DNA的三股螺旋形式,DNA三股螺旋结构常出现在DNA复制、转录、重组的起始位点或调节位点，如启动子区。,第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合：oligo(Py):oligo(Pu)oligo(Py/Pu)第一股是寡嘧啶，中间是寡嘌呤，第三股可以是寡嘧啶或寡嘌呤,第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对。,T=A
25、:A,CG：C+T=A:T CG：G,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。改变介质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,稳定DNA二级结构的作用力：氢键（横向作用力）碱基堆积力（纵向作用力）,三、DNA的三级结构,DNA的三级结构是指DNA分子（双螺旋）通过进一步的扭曲和折叠所形成的特定构象（超螺旋）。,大多数原核生物：共价封闭的环状双螺旋分子
26、。,正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与双螺旋方同相同。负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与双螺旋方向相反。,正超螺旋,负超螺旋,L=23,T=23,W=0,解链环形,1,5,10,15,20,23,环状DNA的不同构象,DNA超螺旋结构形成的意义,使DNA形成高度致密的状态从而得以装入核中；推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,四、DNA与染色体的组装,DNA分子十分巨大，将它组装到有限空间中需高度组织，这种组装可用压缩比来表示(Compression ratio)：指DN
27、A分子长度与组装后特定结构长度之比。,在生物体内的核酸通常都是与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白形式存在。基因组DNA与蛋白质结合形成染色体(染色质)。,1.病毒,噬菌体T2结构,病毒核酸位于头部，由蛋白质（衣壳）包裹。,动物病毒切面模式图,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣壳（蛋白质）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,细菌虽然没有真核细胞的核结构，但其遗传物质也不是完全散开的，细菌的染色体在细胞内紧密缠绕形成致密的小体称为拟核（nucleoid）。,DNA-蛋白质核心,平均一个突环含有约40kpDNA,2.细菌的拟核,细菌的基因组为双链环状DNA，其上结合碱性蛋白和少量RNA，形成许多突环。,3.D
28、NA在真核生物细胞核内的组装,染色质的基本结构单位是核小体(nucleosome)，它由8个组蛋白核心和外绕1.8圈的DNA所组成。由核小体链形成纤丝，进而折叠、螺旋化，组装成不同层次结构的染色质和染色体。,核小体由DNA和组蛋白构成,DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上,组蛋白核心：（H2B,H2A,H3,H4）2,H1组蛋白在核小体之间,DNA的存在形式,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA（2nm）,核小体链（11nm，每个核小体200bp）,纤丝（30nm，每圈6个核小体）,突环（150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（300nm，6个突环）,螺旋圈（700nm，每圈
29、30个玫瑰花）,染色体（1400nm，每个染色体含10个螺旋圈),第三节核酸的理化性质,核酸的理化性质一般物理性质,DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体。都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。DNA和RNA在细胞中常以核酸蛋白复合体（核蛋白）形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。DNA核蛋白 RNA核蛋白 0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,与蛋白质相似，
30、RNA分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性碱基基团，因而RNA也具有两性性质。由于RNA分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以RNA的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI）RNA在其等电点时溶解度最小。RNA的等电点比较低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。,核酸的理化性质核酸的两性性质,1、酸水解 核苷酸的糖苷键和磷酸二酯键均可被酸水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。,2、碱水解 RNA的磷酸键易被碱水解，产生核苷酸，DNA的磷酸键则不易水解，
31、因为RNA上2-OH基，在碱作用下易形成磷酸三酯而易水解。,第一步,第二步,第三步,3、酶水解,非特异性水解多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯酶，特异性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶DNA水解酶（DNases）以DNA为底物，RNA水解酶（RNases）以RNA为底物。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位
32、。,3、酶水解,蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶是从不同末端降解多聚核苷酸的核酸外切酶,牛胰核糖核酸酶（RNase I）作用位点为嘧啶核苷-3-磷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为3-嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。,限制性内切酶是一类重要的作用于DNA的内切酶限制性内切酶识别部位一般都是由4-8个碱基对组成的一段序列，而且有一个二重对称轴，即5-3方向残基序列在DNA的两条链上是一样的，这样的序列称为回文结构。E.CoR I是一个重要的限制性内切酶，它识别由6个碱基对组成的特殊序列（每条链上是GAATTC）。大多数限制性内切酶都是将双链DNA切开，形成两个粘性末端（带有与另一末端互
33、补的单链）限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对的存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列的能力。,E.coR I,二、核酸的理化性质核酸的紫外吸收,1、紫外吸收 DNA和RNA的碱基有共轭双键，而使核酸在240290nm有光吸收，最大吸收在260nm附近。可用紫外分光光度法进行核酸纯度鉴定。纯DNA样品：A260/A2801.8 纯RNA样品：A260/A2802.0 对纯样品：A=1.0相当于50ug/mL双链DNA或40ug/mL单链DNA或20ug/mL寡核苷酸。,2、增色效应与减色效应,2、增色效应与减色效应 有时核酸溶液的紫外吸收用摩尔磷吸光度表示，根据磷含量及紫外吸收
34、值然后算出摩尔磷吸光系数。(P)=A/cL=30.98A/WL 一般天然DNA的(P)为6600，RNA为77007800。由于单链核苷酸的(P)比双链的要高，所以核酸发生变性时，(P)升高，故称增色效应；复性时(P)降低，称为减色效应。,三、核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交,1、核酸的变性（denaturation）是指核酸的双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。变性因素：酸碱、热、尿素等；DNA热变性后一些理化性质改变：260nm紫外区吸收值升高；粘度降低；浮力密度升高；双折射现象消失；,1、核酸的变性（denaturation）,用加热的方法使DNA变性叫做热变性；DN
35、A的变性过程是爆发性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时，即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度（melting temperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。,一般DNA的Tm值在70-85C之间,Tm与下列因素有关：1）DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。,2）G-C的含量：含量越高，Tm越高；经验公式：G-C%=（Tm-69.3）*2.443）离子强度：I越高，Tm越大，DNA宜保存在高浓度盐中。,2、核酸的复性（Renaturation）变性DNA在适当的
36、条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。复性反应的速度用Cot1/2衡量。Co为变性DNA复性时的浓度，t为时间，以秒表示。Cot1/2衡量表示复性一半时的Cot值。,3、核酸的分子杂交（hybridization）将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，
37、慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA在某些区断内有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子，且DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。,Southern印迹杂交（Southern blot）。是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的
38、探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。因RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。,基因芯片（gene chip）是指将现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术与分子生物学技术（如核酸杂交技术、PCR等）相结合，在一定狭小的空间内实现高速度、高通量、集约化和低成本的基因分析技术。它利用核酸双链的互补碱基之间的氢键作用，形成稳定的双链结构，通过检测目的单链上的荧光信号，从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的。目前，比较成熟的产品有检测基因突变的芯片，检测细胞基因表达水平的表达基因芯片等。,
