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1、实训三 细菌的简单染色和革兰氏染色,微生物与发酵工艺,微生物中的细菌，其细胞小而透明，用压滴片或悬滴片在光学显微镜下观察时，菌体和背景没有明显的明暗差，不易看清其形态，更难以识别它们的结构。因此，需要对菌体进行染色，借助于染料使菌体着色后颜色的反衬作用，观察细菌的形状、基本结构(壁、膜、细胞质、核及内含物)及附属结构(荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等)。,1.学习微生物的涂片染色的操作技术。2.掌握微生物的简单染色、革兰氏染色的基本原理和方法。,一、实验目的,微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的。在显微镜下，微生物体与其背景反差小，不易看清微生物的形态和结构。若增加反差。则微生物的形态皆可以看清楚。
2、通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，便于观察。,二、实验原理,微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。经测定，细菌的等电点在pH25之间，故细菌在中性、碱性或偏酸性的环境中，都体现酸性，带负电荷，容易与带负电荷的碱性染料结合，从而使菌体染色。菌体染色分为简单染色和复染.,二、实验原理,简单染色又称单染，只用一种染料使菌体着色。若仅为在显微镜下看清细菌形态，用单染即可。复染是指用两种或多种染料染细菌，目的是鉴别不同性质的细菌，主要方法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。,二、实验原理,革兰氏染色步骤是：先用草酸铵结晶紫染色，经媒染剂碘-碘化钾溶液处
3、理后用乙醇脱色，最后用沙黄染液（也称蕃红染液）复染。如细菌能保持草酸铵结晶紫与碘的复合物而不被脱色，用蕃红液复染后仍呈紫色，则该细菌称为革兰氏阳性菌（G+）；被乙醇脱色用蕃红复染后呈现红色，则称为革兰氏阴性菌（G-）。现在已知，革兰氏染色结果与细菌细胞壁的结构组成有关。,二、实验原理,1.菌种 大肠杆菌(Escherichiacoli)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)普通变形杆菌(Proteusvulgaris),三、实验材料和用具,2.染液 简单染液：齐氏石炭酸复红染液 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液(染液)卢戈氏碘液(
4、媒染剂)95乙醇或丙酮(脱色剂)沙黄乙醇溶液(复染剂)吕氏美蓝染液。,三、实验材料和用具,3.用具 显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、香柏油、二甲苯、牙签、载玻片、纱布、滤纸、镜头纸、镊子、染色缸、火柴、玻片架、烧杯等。,三、实验材料和用具,1.制片 涂片 取保存在酒精溶液中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、染色类型。在玻片中央滴加一小滴无菌水，以无菌操作取少许菌苔，在玻片的水滴中涂布均匀，成一薄层。,四、实验方法,风干 在空气中自然干燥。切勿在火焰上烘烤。固定将已干燥的涂片向上，在微火上迅速通过23次，使得菌体与玻片结合牢固。,四、实验方法,简单染色：在
5、已制好的涂片菌膜处，滴加吕氏美蓝染液染色3 5min，或滴加齐氏石炭酸复红染液染色12min。以流水冲洗涂片。至水无色为止，后用滤纸吸干涂片的水滴，干后，待镜检。革兰氏染色 a.在已制好的涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色lmin，水洗。,2.染色,四、实验方法,b滴加路哥氏碘液媒染lmin、水洗。用滤纸吸干残存水滴。c斜置玻片于烧杯上端，滴加95乙醇脱色并轻轻摇动载玻片。直洗至流出乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5lmin)，脱色完毕后，水洗，滤纸吸干。d滴加沙黄染液复染lmin。水洗，滤纸吸干后，备镜检。,四、实验方法,五、实验内容,1.用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌制简单染色片，在油镜下观察。2.用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌制革兰氏染色片，油镜下观察，区别革兰氏阳性菌和阴性菌。,1.试述革兰氏染色的程序及染色原理。2.将本实验观察结果记录于表中。,六、实验报告,1.为什么细菌染色时所用的染料多属于碱性染料?为什么涂片需要固定?为什么制片干燥后才能用油镜观察?2.革兰氏染色过程中，哪些因素是成败关键，为什么?,七、思考题,
