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1、序列分析及引物设计专题,郭志富2012年11月21日,测序序列如何确定是否为目的序列？如何去除载体序列？如何转换成有义链？如何找到序列起始和终止位置？,一、序列分析部分,第一步：BLAST,输入测序序列,选择物种,选择比对类型,去除序列中此数字之前的序列，一般前50-80bp要么是载体序列，要么是测序不准确的端部,一般序列较短时，开始比出来的有可能是载体序列，此时需在测序序列中去掉比对数字之后的序列，也就是去除和载体序列一致的序列。把目的序列重新输入进行比对。,去除序列中此数字之后的序列，一般为载体序列,根据目标序列的方向判定检测序列是否为有义链：如果检测序列（Query）顺序与目标序列（Sb
2、jct）顺序相反（上边的序列从左到右是递增，下边的目标序列是递减），则检测序列需要进行反转。如顺序相同则可能为有义链，再根据氨基酸翻译情况具体确定。,第二步：序列整理与分析-DNAman软件的应用,点击,粘贴待分析序列,输入”ORIGIN”,选择序列后点击载入,序列的不同显示类型（互补、反向、反向互补等）,去除此部分后保存，即得到反转后的有义链,翻译为氨基酸序列,有义链翻译后，三个可能的读码框中其中有一个为连续的氨基酸序列，即不总出现终止密码子（*）。这条氨基酸序列可保存后进行序列分析。如是全长编码区，需要找到起始密码子ATG(M)，和终止密码子TAGTGATAA（*）,此图对于设计体外表达引
3、物或转基因载体构建引物十分重要。原则为：设计引物添加酶切位点必须是目的基因中没有的酶切位点。,多序列比对,应用：简并引物设计差异位点分析（SNP或氨基酸差异等）进化树的构建,保守区,DNAMAN1形式,DNAMAN2形式,GCG形式,GDE形式,选择某区段,引物设计专题,分子生物学实验基础之,生物科学技术学院 郭志富 2011年11月8日,简并引物设计：基于保守区设计，用于保守区片段（或中间片段）获得定量引物设计：用于半定量和实时荧光定量PCR标记引物设计：基于特异区设计，用于标记特异基因或特异物种材料。表达引物设计：用于原核体外表达、真核表达（转基因）SNP引物设计：用于单核苷酸突变鉴定RA
4、CE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段甲基化引物设计：用于检测基因甲基化情况。,引物设计分类,.的常规应用,结合,激活软件,？,获取激活码,“Ctrl+V”输入序列,也可以把上下游引物分别设在序列的某一特定位置,界定产物长度,界定引物长度,在55-65之间调整,简并性引物的设计,1.基于保守性的简并位置选择（3端尽量不设置简并）2.用Primer 5.0检测大致的评分（主要看Tm值和发夹结构和引物二聚体情况）,复制,同源克隆-基于不同物种（范围较广）相应序列保守区的引物设计-通过已知序列信息钓取未知的同源基因,“Ctrl+V”输入引物序列,上游引物,下游引物,简并引物的确
5、定（上游）5-CA(A/G)AAGAT(C/G/T)GA(G/A)AT(C/A)TT(C/T)AAATC-3,如确定该位置为下游引物3-GT(T/C)TTCTA(G/C/A)CT(C/T)TA(G/T)AA(G/A)TTTAG-5,表达引物的设计,ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGAAGTAGAATCC,起始,信号肽编码区,N端编码区,终止,ATGTGACCATGCATGCAGTTCGGACGAAGCCGTACGTAC-GCAGTGCAGTCATGCAAAGCGTACGTACGTAGA
6、AGTAGAATCC,ATGTCGGACGAAGCCGTACGTA,上游引物的设计,添加ATG起始密码子,5-GCGAATTCATGTCGGACGAAGCCGTACGTA-3,添加酶切位点,1.编码区内不含该位点2.5端添加保护碱基2-3个（网上有规律表）3.不能造成下游的移码,去除信号肽编码区部分,1.位置必须选择含终止密码子子位置或终止密码子之后不远的一部分序列，2.记得要是有义链的反向互补链，3.同样加酶切位点和保护碱基,下游引物的设计,定量引物的设计,扩增长度：100-300 bp范围即可,以mRNA为模板进行设计,尽量避免引物二聚体、发夹结构等的出现,引物设计避免DNA污染可能带来的
7、干扰，最好跨外显子接头区,Tm值在58-62度 内参引物设计：选取持家基因，如18SRNA、actin等 长度与特异基因有所差异,设计范围在编码区内,界定产物长度在100-300bp,应用Primer 5.0软件常规应用功能即可,标记引物的设计,（特异性）,选择非保守区段，特异性的位置设计在3末端；（SSR等特征序列的两侧）,特异区段,RACE及染色体步移引物设计：基于已知序列，用于获取未知序列区段,RACE引物的设计,如果基因是多拷贝或为多基因家族，须在所得不同片段特异区设计与接头引物Tm值相差不宜过大产生嵌套引物，位置合理,SNP引物的设计,何谓SNP？SNP位点设置在3最后一个碱基倒数第
8、三个碱基人为引入突变-保证引物特异性,5-CTAGGTACTGGATTAGT-3,甲基化引物的设计,何谓甲基化？-亚硫酸氢盐-C变T 准确寻找甲基化位点，至少一个，多多益善设计野生型对照CpG位置尽量靠3端,一段基因组的序列是：5-GAGGGGCGGCCGCACCGGG-3,甲基化引物：5-GAGGGGCGGTCGTATCGGG-3非甲基化引物：5-GAGGGGTGGTTGTATTGGG-3,3.MEGA3.1软件的应用,第一步:点击file,选择”convert to MEGA format”,点击选择保存过的CLUSTAL或DNAman(GCG)比对文件,选择相应的格式,对应DNAman的GDE格式,把比对结果转换为*.meg的格式,保存,查看*.mega文件最后行是否正常,为了保证各比对序列的长度相等,保存到指定文件夹,点击,点击可进行参数编辑,不同形式进化树,谢 谢,
