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1、第三章 蛋白质结构解析技术,结构功能一级结构高级结构解析蛋白质结构破译折叠密码,第四讲 蛋白质结构解析技术（一）,氨基酸序列分析X-射线衍射技术,核磁共振 质谱技术 结构分析的其它方法现代光谱技术三维电镜重构技术动力学全局研究技术,UV-Vis、IR、荧光、CD、激光拉曼,蛋白质结构和构象；构象变化过程；如：蛋白质折叠过程中间态形成的时间尺度和机制.二级结构形成、卷曲过程，变性和复性过程及机制。,主要内容,是结构与功能研究的基础,第一节 蛋白质氨基酸序列分析技术,主要内容化学法基因方法蛋白质分子中二硫键和酰胺基位置的确定蛋白质测定新技术,一级结构测定的意义：寡核苷酸探针的设计与制备 cDNA推
2、导氨基酸序列提供依据 重组DNA产生的蛋白指纹分析蛋白质的完整结构鉴定确定翻译后修饰的位点决定簇的定位二硫键的确定,一、蛋白质测序的研究历史,采用部分水解的方法试图测定蛋白质的氨基酸序列,Consden等利用色谱技术成功测定了短杆菌肽S6的氨基酸序列,Sanger首次测定了牛胰岛素的一级结构（由51个氨基酸残基组成）,Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段,Edman 推出第一台全自动测序仪,N-末端氨基酸的测定方法（主要5类）1、二硝基氟苯法（DNFB法、Sanger法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）DNS-氨基酸呈
3、荧光3、异硫氰酸苯酯法（PITC法）4、DABITC法（甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯），形成的DABIH氨基酸呈桔黄色（有颜色）5、氨肽酶法N-末端测定的方法奠定了序列测定方法发展基础,牛胰岛素（51aa）的一级结构,Sanger首次(DNFB法)测定了牛胰岛素的一级结构 Sanger法（测定蛋白N末端的方法）,二、序列测定方法化学方法,（一）N端测序法应用最广的N端顺序测定法大多仍以Edman降解原理为基础设计。利用化学试剂和控制反应条件，从N端开始，将肽链逐步降解，进行氨基酸序列的测定的方法。1、Edman降解法异硫氰酸苯酯（PITC）法特点：可以测定氨基酸的排列顺序（包括N端分析）。适用于手
4、工操作，也可设计自动化测定仪器（1）原理：四点：异硫氰酸苯酯(PITC)偶联 ATZ-氨基酸裂解 PTH-氨基酸转化 PTH-氨基酸的鉴定,偶联：自由-氨基与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。,裂解：在无水条件下酸（F3CCOOH）裂解，形成苯氨基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）和失去末端氨基酸残基的多肽，又可与PITC进行偶联反应，下一轮降解。,转化：ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）可转化成稳定的PTH-氨基酸。,PTH-氨基酸的鉴定：可以通过薄层层析、气相色谱、高效液相色谱及质谱等各种手段进行分析。,乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH
5、氨基酸)。,PITC试剂,ATZ-氨基酸,单向纸层析,氨基酸鉴定PTH-氨基酸,与标准氨基酸（PITC试剂反应）对照,双向纸层析,薄层层析（TLC）,高效液相色谱（HPLC）（high performance liquid chromatography）,（2）氨基酸序列分析仪器以Edman法测序，手工操作繁琐，工作量大根据Edman降解的原理自动化分析仪器自70年代初全自动序列仪诞生以来，经过了一系列更新换代，仪器日趋灵敏、快速。灵敏度达0.1 pmol 蛋白3种代表性的测序仪器简单介绍如下：,液相旋转杯序列仪最初的自动化仪器，对自动化测序意义很大。测定程序：整个仪器的“核心”部分是一个反应
6、杯，它由一个马达带动并有调速控制。蛋白质或多肽样品经导管注入反应杯，通过旋转离心力被均匀地涂在杯壁上，形成一层薄膜，其厚薄可由转速控制。反应试剂和溶剂分别通过导管进入反应杯，与杯内薄层上的样品的N端自由氨基进行Edman反应；降解下来的ATZ氨基酸衍生物通过另一导管引出并收集；再将ATZ氨基酸PTH氨基酸鉴定；洗涤反应杯，依次循环分析。特点：该仪器样品流失较大，样品消耗量大，目前已很少使用。,固相序列分析仪发展的动力和原因：克服液相旋转杯分析仪的缺点。多肽不易吸附旋转杯上，样品流失较大；原理：蛋白质C端羧基共价固定在惰性载体上，进行Edman降解。特点：样品与载体共价结合，洗涤和抽提等过程不会
7、丢失样品，增加循环次数。缺点：（1）若多肽中其它残基的羧基与载体结合，影响测定。如：酸性氨基酸残基（Asp、Glu）（2）测定效率低,3-氨基丙基玻璃,N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基玻璃,惰性载体,成功的关键是肽段的固定，目前采用C端-羧基固定法，重复法高，高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可达90-95%。,气相蛋白序列分析仪弹筒型玻璃反应室反应室容积0.05 ml，代替液相序列仪中的旋转玻璃杯，用一种惰性聚合物“polybrene”固定样品。多肽链与气态试剂反应，完成Edamn降解。优点：灵敏度高，耗费样品量少，通常仅需10100 pmol；试剂和溶剂消耗少，大约是液
8、相序列仪的110，降低了费用；缩短了每步降解循环时间，提高了分析效率。趋势：灵敏度不断提高,气相蛋白序列分析仪,（3）Edman方法改进 DABITC法：1976年，（华裔科学家）张瑞耀提出试剂：甲氨偶氮苯基异硫氰酸苯酯 替代了 异硫氰酸苯酯（PITC）DABITC：4-N,N-对甲氨基偶氮苯-4-异硫氰酸酯原理：与PITC相似，形成有色产物DABIH氨基酸，呈桔黄色也称为有色的Edman降解法，氨基酸鉴定无需染色，肉眼可分辨特点：灵敏度很高，分析小肽段只要几个nanomole样品即可。但DABITC试剂与多肽N端aa耦合率低（20%-30%），测序干扰大！如何解决？DABITCPITC两种方
9、法耦合，更加灵敏可靠。适用于：液相还是固相，手工还是自动方法，效果良好。异硫氰酸酯进行35S标记：使分析样品更向微量化方向发展。,二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）荧光剂DNS-Cl，与肽链N端氨基反应生成DNS-肽经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨基酸，检测灵敏度提高310倍。乙酸乙酯抽提，层析鉴定，DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。,6 M HCl，110水解过夜 DNS-脯氨酸70%被破坏。Gln Glu，Asn Asp Trp及其DNS衍生物完全被破坏(可用巯基乙烷磺酸真空下水解),特点：不能连续降解，适用于N末端分析,（n-1）肽
10、,荧光？,DNSEdman测定法两种方法的结合DNS法，灵敏的高，但不能连续进行Edman降解法,思考？为何要创新很多方法？什么样的方法能延续下去？,（4）氨基酸自动序列仪的使用方法依据Ednan原理，氨基酸自动测序仪，序列分析加快测序仪发展方向：微量化、自动化加样量达到微量：10-910-12mol水平推出从进样到色谱分析一体化分析仪举例：Shimadzu（日本岛津）公司 PPSQ-21A 氨基酸自动测序仪工作原理：Ednan降解，产物乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），柱前衍生的液相色谱（HPLC）分析。,工作流程,（5）影响N端Edman反应裂解率的因素在测序中，即使N端很均一的蛋白质
11、(第一个循环出现单个氨基酸残基)，经过十几个循环后背景明显不及第一个残基清晰。原因：Edman反应是一个化学过程，在其偶联、裂解、转化等步骤都有可能发生一些副反应，从而影响最终裂解效率。三氟乙酸除了裂解作用外，可与Ser和Thr上的-OH反应，继而部分封闭Ser和Thr的N端-氨基，导致Ser和Thr时产率突然降低。Ser和Thr的PTH-衍生物部分转化成其他产物，造成产率降低。偶联试剂PITC本身也将发生副反应，形成一些“杂质”。,（6）N端测序前样品处理纯度鉴定（97%）脱盐疏基修饰去除N端封闭的基团（酸水解，酶处理）,（二）C端测序法虽然自动化N端测序技术日趋成熟，但仍有不少问题需借助C
12、端序列分析来解决（？）C端测序优势：尤其适合于基因重组蛋白是否正确表达的鉴定（Why？）大规模生产时的质量控制、N端封闭蛋白的分析DNA探针或引物的设计。（不做详细讲述，感兴趣者自己阅读学习）,1、原理（C端分析）基于与N端Edman降解类似的原理，采用化学试剂与蛋白质和多肽的-COOH反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分离分析。已有自动化的C端序列分析仪,(1)活化C端的自由羧基与乙酸酐反应生成混合酸酐，混合酸酐再环化成聚噁唑酮，在四丁基铵硫氰酸盐的作用下，转化为乙内酰硫脲(TH)。而侧链上的羧基形成的混合酸酐则难以成环。,2、C端序列分析程序,六个步骤、羧基活化侧链
13、羧基保护烷基化TH肽侧链羟基保护断裂形成ATH-AA AA分析,(2)侧链羧基的酰胺化保护 侧链羧基形成混合酸酐，与哌叮硫氰酸盐（piperidine thiocyanate）进一步作用形成酰胺，以保护侧链羧基。,(3)烷基化C末端环化成的乙内酰硫脲（TH）衍生物较为稳定而不易被切割，产率不高。选择性地烷基化修饰硫原子，形成烷基化-TH(ATH)衍生物，裂解产率将大大提高。,(4)修饰侧链羟基（保护）Thr和Ser残基的侧链上具有羟基羟基不稳定，会干扰测序，需要修饰。乙酸酐将羟基乙酰化，但反应不完全。N-甲基咪唑（NMI）和乙酸酐共同作用，将Thr和Ser的羟基乙酰化。,(5)裂解和衍生C末端
14、ATH衍生物在酸性条件下与硫氰酸盐反应而被裂解生成ATH-氨基酸。新的C末端自动环化形成乙内酰硫脲（TH），而不必重新活化。整个测序过程只需在开始时对C端进行一次性活化，并修饰Asp和Glu侧链羧基，以及Thr和Ser的羟基。(6)ATH-AA 分析（常规分析）,小结C末端测序程序羧基活化侧链羧基保护烷基化TH肽侧链羟基保护断裂形成ATH-AA AA分析测定C端第一个和第二个氨基酸工艺的区别,3、C末端蛋白质序列仪可由N端序列仪改装而成，不同之处主要在于:(1)反应所用的试剂不同，两者不兼容，否则易堵塞管道。C端序列仪：所有的化学反应均在弹筒型反应室中进行，切割下来的ATH-AA仅在转化腔内干
15、燥和溶解后即可进入HPLC系统分离分析。N端测序仪：ATZ-AA需在转化腔中转化为PTH-AA。,4、C端测序样品前处理纯度鉴定 脱盐疏基修饰-氨基的衍生,5、影响C端测序反应产率的因素不同的氨基酸的反应产率不同，图谱分析比N端测序复杂。C端测序副反应较多，最高起始产率仅为20%，Glu Asp Ser Thr等残基的产率更低。若C端富含这几种残基，测序十分困难。Pro残基终止测序过程Pro 残基有吡咯环，其羧基与乙酸酐反应不能成环。一旦遇到Pro，整个测序过程将终止。到目前为止，C端序列可测 l10个残基，平均35个，一次测序需要的量比N端测序要大得多，至少需1nmol。作为N端测序的补充。
16、,（三）蛋白质一级结构测定步骤,蛋白质水解多个短肽测定每个短肽的序列序列拼接蛋白质序列二硫键和酰胺位置的确定,1、酶解和分离,长肽链降解成短肽以利于多肽的序列测定长肽链降解成短肽与氨基酸测序结合进行序列分析长肽链降解成短肽以利于测定肽谱常用酶及降解位点胰蛋白酶 Lys、Arg等碱性aa羧基端，不切-Arg-Pro-、-Lys-Pro-胰凝乳蛋白酶 芳香aa羧基端胃蛋白酶 Phe、Trp、Leu、Ala等aa羧基端梭菌蛋白酶 Arg等碱性aa羧基端V8蛋白酶 Asp、Glu等酸性aa羧基端Lys内肽酶 Lys羧基端优点：专一性强、条件温和、副反应少、水解率高,短肽分离：采用HPLC方法蛋白质分离
17、纯化章节详细介绍方法和原理,测序不能太长，常常需要酶切测序，肽链拼接。（拼图游戏）根据肽链测序结果若一条简单肽链：仅有12个断裂点，根据N和C末端氨基酸，很容易确定其一级结构。若为复杂的肽链：不能只靠一套肽链断裂方法，需要两套甚至更多的断裂方法分别测序，通过查找叠肽的方法，分析确定完整的氨基酸序列。举例说明：（拼图）,2、肽链拼接重叠肽法,一条15个氨基酸残基组成的多肽，其N末端为His，C末端为Glu。采用两套断裂方法分别测序：第一套将肽段断裂成5个小片段，其序列分别为Lys-Trp-Glu，Cys-Glu，Asp-Lys-Va-Asp，Leu-Pro-Ala和（1）His-Lys-Ile-
18、Tyr。第二套肽段断裂为Glu-Asp-Lys，（4）Ile-Tyr-Lys-Trp，Val-Asp-Leu-Pro，（2）Ala-Cys-Glu和（3）His-Lys。通过N、C末端及重叠肽最后可定编为：,His-Lys-Ile-Tyr-Lys-Trp-Glu-Asp-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Ala-Cys-Glu,3、二硫键和酰胺基位置的确定（1）为何要确定？Cys如何存在，是否形成二硫键Gln和Asn在测序过程中水解形成Glu和Asp（2）二硫键位置的确定方法（对角线电泳、测序法）用碘代乙酰胺保护蛋白样品中未参与二硫键的巯基；（胃蛋白酶）水解，水解肽段进行对角线法电泳分离
19、。点在方形滤纸中心点上，进行第一相电泳分离(pH 6.5)。将滤纸用过甲酸蒸汽熏蒸，二硫键氧化成半胱氨磺酸。（酶切片段 若含有二硫键，即分成2个小肽）第二向电泳，含半胱氨磺酸的肽比原来小，且带了更多的负电荷，偏离了对角线，其余肽均对角线位置上。（Why？）染色后，剪下偏离对角线的肽斑，分析其氨基酸顺序，与已确定的氨基酸顺序比较，即可确定二硫键的位置。,（3）酰胺基位置的确定方法：肽链酶解片段定量NH4推测法肽链中酰胺基以Asn或Gln形式存在。酰胺基水解可释放NH4，测定NH4量推测酰胺基的含量。蛋白水解酶水解分离，可以得到含有酰胺基的肽段。测定其酰胺基数和推测可能形成酰胺基的数量，如果二者数
20、量相等，就可以确定酰胺基位置。若不符，应将肽链裂解为更小片段，再测酰胺基含量和可能存在的位置数目，直到两者相符为止。,三、序列测定其它方法基因序列分析法,（1）原理：翻译密码子（2）步骤：蛋白质N末端和C末端氨基酸分析特异性引物设计 总mRNA提取（特定蛋白质）：分离法：免疫法结合蛋白与mRNA分子杂交。克隆mRNA：测定蛋白质N端1015残基序列，设计兼并引物。cDNA序列分析：RT-PCR，测定cDNA序列（？方法）例如：荧光标记的双脱氧核苷末端终止法（？）全自动系列分析仪，1000bp/反应，简单快速，成本低廉根据密码规则读取蛋白质序列。,四、蛋白质测定新技术（分离纯化部分再介绍）1、高
21、效液相色谱（HPLC）用于蛋白质、多肽和氨基酸的分析色谱填充料：大孔径烷基化硅胶吸附剂（C18）普通孔径：510um进一步提高分析速度和灵敏度大孔径：310-5mm（大肽）小孔径：110-5mm（小肽）,（1）微柱高效液相色谱（microcolum-HPLC）柱直径 2.1mm(普通4.6mm)，Ishii 首次提出是低分子量蛋白或肽的基础样品用量少，速度快，灵敏度高（1pmol），峰形尖窄，回收率高，非特异性吸附少。是目前肽谱分析最灵敏最先进的技术之一应用于肽谱和基因工程产物的分析,（2）无孔色谱短柱填充直径1.5um无孔硅胶，达到快速分离。特点：显著改善分析灵敏度缩短分析时间（几分钟完成）
22、减少生物分子的非专一性吸附（回收率100%）降低洗脱体积（几个微升1mL）可耐受较高压力（30MPa）,（3）毛细管液相色谱1995年 Yamada建立柱内径：250um500um，填充物直径3-5um，孔径310-5mm，2.5ml注射泵，流速仅35 uL/min，上样量525ul，检测器：紫外或激光诱导荧光检测器毛细管流出样品直接点样到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上，样品用刀片割12mm条带，用于蛋白质序列分析。灵敏度很高,2、毛细管电泳（CE）20世纪90年代 微量分析技术材料：熔融石英玻璃，内径小（100um）上样量极少（10uL）,灵敏度高，比HPLC高2个数量级（10-15mol）分类
23、：毛细管区带电泳（CZE）；荷质比等电聚焦电泳（CIEF）；等电点微团电动毛细管电泳（MECC）；疏水或离子交换毛细管筛分电泳（CSE）；分子大小和电荷毛细管柔和免疫电泳（IACE）：与抗体结合专一性,本节小结蛋白质一级结构的测定化学法测定原理及方法 重点N端降解的原理、方法和影响因素，特别是Edman降解及其方法改进。三种序列分析仪（旋转杯、固相、气相）简单介绍了C端降解法的原理、方法和仪器，化学法测定蛋白质序列测定的步骤酶解、分离纯化、肽段序列测定、序列拼接、二硫键和酰胺基位置的确定简述基因序列分析原理和方法HPLC和毛细管电泳等蛋白质测定新技术（略）,第二节：X-射线晶体结构分析,本节主
24、要内容研究进展基本概念基本原理特点,X 射线衍射技术：精确测定原子在晶体中的空间位置的一整套测量及分析技术，是迄今研究生物大分子结构的主要技术。,1.研究进展,背景 1895年，伦琴发现X射线1913年 布拉格父子用X射线衍射法对氯化钠、氯化钾晶体进行了测定1915年 布拉格父子因此获诺贝尔物理奖，建立了晶体学1934年 第一张蛋白质-胃蛋白酶单晶体1957年-1959年 相继8种蛋白质获得了高分辨率结果1960年以后 从单纯的结构学迈入结构-功能研究。1990年以后 突飞猛进，15个结构/天2003年，PDB收录的84.8%蛋白结构数据来自X-射线衍射,我国的标志性成果1,中国科学院生物物理
25、研究所和植物研究所“菠菜 捕光复合物LHC-II 晶体结构（2.72A）2004年，世界上权威性的著名杂志Nature该晶体的结构彩图被选作该期杂志的“封面照片”。世界上率先完成了这一具有高度挑战性的国际前沿课题。推动了中国“光合作用机理与膜蛋白三维结构”研究进入国际领先水平。意义：基于精确的结构数据对高等植物的光能吸收、传递和光保护等光合作用机理研究的热点问题进行了探讨，发现了膜蛋白结晶的第3种类型，TYPE-III膜蛋白晶体，并建立了包括膜蛋白、色素分子和脂分子在内的蛋白脂质体的完整的结构模型，提供了近3万个独立的精确的原子坐标。,匡廷云院士,2005年7月1日，清华大学+生物物理所解析了
26、“线粒体膜蛋白复合物II”的精细结构意义：填补了线粒体结构生物学和细胞生物学领域的空白，称为线粒体呼吸链研究领域的一个新的里程碑。为线粒体疾病研究提供了真实可靠的模型,我国的标志性成果2,晶体：离子、原子或分子等粒子 在三维空间上重复排列形成的有规律的高度有序结构。点阵：晶体的几何图形。晶体中的粒子，在空间上按一定的重复规律排列而成的几何图形。晶格：晶胞是构成晶体的基本单元。按确定的单位划分成空间格子，在晶体中称晶格。,NaCl晶体,2.晶体的基本概念,2d sin=k(k=1,2,3，：掠射角)2d cos=k(k=1,2,3，：入射角),布拉格X射线衍射原理,布拉格衍射,布拉格公式,3.晶
27、体结构测定程序,（1）样品制备：要求纯度达95%以上浓度通常在10 mg/ml50 mg/ml以上（2）结晶和晶体生长（掌握）原理、结晶（晶体生长、影响因素）及鉴定（3）衍射及数据的收集和处理：（4）位相确定：（5）模型的建立和修正：,结晶原理：在饱和溶液中，蛋白质分子间以规则方式慢慢堆积形成高度有序的结构。晶体生长：首先形成晶核。晶核形成的影响因素有：化学：pH、沉淀剂种类、离子强度、蛋白质浓度等；物理：溶液达成过饱和状态的速率、温度、重力、压力、震动、时间、电场磁场、介质、粘度、均相和非均相等。生化因素：纯度、配合体、抑制剂、聚合态、等电点等。结晶方法：批量结晶法 batch crysta
28、llization透析法：crystallization by dialysis液相扩散法：liquid diffusion气相扩散法（Vapor Diffusion Method）。多孔材料吸附蛋白而让其生长：bioglass 钙+磷酸+硅 晶体的鉴定 硬度、稳定性、染色、蛋白质电泳、偏振光、密度差法、沉降性能等。,（2）结晶,蛋白质的晶体,四园衍射仪基本构造,（3-1）四园衍射仪（全方位测定晶体）,（3）衍射及数据的收集和处理,（3-2）衍射举例溶菌酶蛋白X线衍射图,X线衍射探视物质微观结构的一双“锐眼”！当一束强光穿过溶菌酶蛋白质晶体，显示器上出现了一幅精细的晶体衍射图像中国科学院“上海
29、光源”获得了第一幅生物大分子晶体衍射图像！文献来源：文汇报 2009-4-10 记者 许琦敏,富兰克林和她的DNAX光衍射结果,（3-3）衍射及其数据的收集和处理衍射和数据收集 中等大小晶胞的一套高分辨率数据，至少收集几万个衍射强度数据，X-射线源：强度高，时间短（同步辐射）温度：低温液氮 数据收集：现获现测，与衍射同时进行，数据处理 经过专门的数据处理，给出一套数据的各种统计结果，才能判断数据质量的好坏。需要筛选多个晶体，选择最合适的衍射质量和取向的样品 突变蛋白等需要很少的实验就可以测定结构 膜蛋白或多结构域蛋白需要几百次实验，才能获得好的模型发展方向：自动化操作，软件的开发,(3-4)位
30、相确定：解决衍射点的位相问题关键环节分子置换法（MR）多对同晶型置换法多波长反常散射法（MAD）(3-5)模型建立和修正获得电子密度图：依据衍射线的振幅和位相，依据公式计算电子密度图，包含了结构的全部信息电子密度图解析：结构模型显示系统和相关软件结构模型建立：反复修正原子坐标、改善位相模型的修正：软件处理，获得结构模型和结构参数。,是迄今研究蛋白质结构最有效的方法优点：不损伤样品：水溶性蛋白、膜蛋白、大分子组装体与复合体分辨率高，：能达到的精度是其它任何方法所不能比拟的。无污染、快捷能得到有关晶体完整性的大量信息 蛋白质分子大小：10nm 分子中原子的距离：0.1nm=1A X-射线的波长：0
31、.5A-1.5A 缺点：蛋白质分离纯化技术要求高蛋白质晶体难以培养，晶体结构测定时间较长。很难捕捉到分子的动态信息,4.优缺点,本节小结晶体及衍射的基本概念蛋白质晶体X衍射基本程序X衍射分析蛋白质结构的优缺点,蛋白质N端测序仪器基于的化学原理是什么，简述之。代表仪器有哪些？它们有什么进步？N-末端氨基酸的测定方法有哪些，简述之。蛋白质Edman降解法的原理，Edman降解法的改良方法有哪些，简述之。简述蛋白质C末端降解测序的程序氨基酸分析仪测序操作流程。C末端与N末端蛋白质序列仪有哪些相同和不同之处。试比较C末端与N末端蛋白质序列的优缺点（影响因素）。化学法一级结构测定的步骤有哪些，简述之。基
32、因测序法翻译蛋白质一级结构的实验方法。如何确定二硫键和酰胺基位置，为和要确定？X 射线衍射测定蛋白质构象的原理和基本程序。,思考题,第三节 核磁共振技术Nuclear Magnetic Resonance（NMR）,原理适用范围及优缺点基本概念核磁共振结构测定基本程序,另外，蛋白质的晶体状态与自然状态也不尽相同，在分析的时候要考虑到这个问题。核磁共振技术可以分析液态下的肽链结构，这种方法绕过了结晶、X射线衍射成像分析等难点，直接分析自然状态下的蛋白质的结构。现代核磁共振技术已经从一维发展到三维，在计算机的辅助下，可以有效地分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以及酶催化
33、的动态机理。从某种意义上讲，核磁共振可以更有效地分析蛋白质的突变。,1.核磁共振波谱仪原理,1永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。扫场线圈。2 射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。60MHz或100MHz。3 射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4样品管：外径5mm的玻璃管,测量过程中旋转,磁场作用均匀。,与UV-vis和红外光谱法类似，NMR也属于吸收光谱（是处于强磁场中原子核对射频辐射的吸收,核磁共振波谱仪,2.适用范围及优缺点,近生理状态溶液中的蛋白质构象测
34、定蛋白质分子动力学（在s到ps时间尺度上）小分子和蛋白质作用的动力学过程蛋白质可变形尾巴部分的构象观察蛋白质结构的运动过程（主侧链运动、不同温度和压力下蛋白质的折叠和去折叠过程）结构定性和定量分析非损伤性测定法，对样品无破坏作用，但不能太大，溶解性要好，稳定性要高，不降解不聚合，可进行同位素标记等。,缺点：灵敏度低适用分子量较小的蛋白质,3.基本概念,4.NMR结构测定基本程序,纯度：不应有铁及其它杂质、粘度要低、浓度：5-10%；5mg(1H),15-30 mg(13C)；傅立叶变换-NMR需1 mg 溶剂：1H谱=四氯化碳(1H),、二硫化碳 氘代溶剂：氯仿、丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物标
35、样浓度（四甲基硅烷 TMS）：1%,样 品1D-2D-3D（一级和二级结构)计算出三维结构能量最小化优化 高分辨率三维结构几何,NMR详细步骤,1.样品制备：将蛋白质溶于D20或H20中，相对分子质量大于6000的需要事先用15N或15N、13C加以标记2.一维NMR实验：测定1HNMR谱图。用D2O交换以及做pH、温度的影响实验，以获取化学位移、耦合常数以及有关形成氢键等信息3.二维NMR实验：测定1H-1HCOSY等，以确定耦合体系，辨别氨基酸类型，进行序列识别，并根据NOE信息确定各种二级结构单元等。4.三维NMR实验：测定CBCA(CO)NH,CBCANH,HNCO,HNHA,HCCH
36、-COSY,NOESY-TOCSY等的三维图谱，进一步确认各自旋体系5.四维NMR实验：测定13C/15N编辑的NOESY或13C/13C编辑的NOESY谱，对重叠严重的一些谱峰的NOE相关性进行分析,碳谱与氢谱的对比,碳谱与氢谱的对比谱图去偶作用对比,膜蛋白3D结构研究日益增多越来越多的实验室涉足这一领域新的方法将进一步推进膜蛋白3D研究在膜蛋白样品制备方面，更多的经验积累将极大推进人们对膜蛋白与不同去污剂，不同的磷脂之间的相互作用的理解，将避免尝试一些不利于膜蛋白稳定结构的去污剂，大大加快正确去污剂筛选的速度,膜蛋白研究,？膜蛋白样品中，还包含有去污剂或磷脂分子，这样，膜蛋白的1H信号将和
37、去污剂/磷脂中的1H信号相重叠，而很难获得只含有膜蛋白的1H信号的核磁光谱在实验过程中，需要采用含13C和或15N标记的膜蛋白，再依靠核磁共振同位素过滤脉冲序列特异性获得膜蛋白的信号，并进一步进行膜蛋白的结构研究 蛋白质通常溶于pH7、盐离子浓度大约10-50mmolL的水溶液中。除了缓冲液必须盐组分，有时还加入少量的甘油、异丙醇、蔗糖、精氨酸和谷氨酸等，以提高蛋白质的溶解度和稳定性。,第三、其它结构测定方法,Uv-vis荧光光谱CD(circular dichroism)：稀溶液中蛋白质二级结构的一种简单快速又较准确的方法,是利用不对称分子对左右圆偏振光系吸光率的不同来分析蛋白质结构。激光拉
38、曼光谱（瑞利散射和拉曼散射）：适用从固到稀溶液样品；物化处理后样品，对样品没有破坏性，可得到一级和二级结构信息。质谱：ug级样品，一级结构的分子量、氨基酸排序、二硫键数目和位置；三维电镜重构法：是电子显微束+电子衍射+计算机图像处理 是对电子显微图像进行傅里叶变换，得到三维结构。直接获得分子的形貌信息；适合样品范围更宽，尤其是难以结晶的膜蛋白和生物大分子复合体；可捕捉动态结构变化信息；易于和其它技术结合得到高分辨率结构信息，相位确定更直接和方便（质量高于同晶置换法，不需要重原子衍生物），是结构分析的重要补充。7 动力学全精研究技术（dynamics ensemble ferinement DE
39、R）两个NMR（分子可能移动范围或其它结构内运动）+分子动力学（分子在蛋白质内移动）。用动力学及结构信息来绘制蛋白质移动的全范围图谱。运用NMR的序参数，模拟分子动力学，得到一套代表蛋白质结构及其动态变化的构型。,蛋白质结构预测,一、同源建模是最常用最有效的蛋白质结构预测方法。前提是需要用同源蛋白质的已知结构作为模板。当缺乏这种模板结构时，预测很难奏效！能否从蛋白质氨基酸序列出发，直接预测蛋白质的结构。二、反向折叠法三、从头预测法,由于对不溶的聚集体或沉淀蛋白质的研究存在困难，相对于蛋白质的失活过程，人们更感兴趣的是对从活性态到失活态的可逆转变过程的研究。但对蛋白质工程来讲，如果使使胞内不溶的包涵体溶解，并使溶解的多肽链复活，仍是具有重要意义的研究课题。,
