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1、细 菌 的 革 兰 染 色 法,一、实验目的,1、了解革兰染色的原理。2、掌握革兰染色的方法。3、掌握细菌的基本形态和结构。,二、试验原理,细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精或丙酮脱色，再用复染剂（番红）染色，如果细菌不被脱色而保持原来染料的蓝紫色者，为革兰氏阳性菌；如果被脱色，而被染上复染剂的红色者则为革兰氏阴性菌。,革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌染色差别的原因,G+菌细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质含量少，乙醇不易渗入脱色。G-菌细胞壁结构疏松(肽聚糖层薄)，且脂质含量多，乙醇溶解脂质后易渗入细胞而脱色。G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌
2、不被乙醇脱色。G-菌菌体核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。G+菌等电点比G-菌低，在同一pH值条件下阳性菌比阴性菌所带负电荷要多，故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。,三、试验材料,显微镜、酒精灯、火柴、牙签、载玻片、吸水纸、擦镜纸、香柏油、二甲苯、生理盐水、蒸馏水草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏（Lugol）碘液、95%乙醇、蕃红红染液口腔中的细菌,四、操作步骤,1、标本片制备取载玻片1块，加1滴生理盐水。用牙签小心轻刮自己舌苔几下，盐水中混匀涂成一薄层。在室温下自然干燥。用片夹夹住玻片通过火焰3次固定标本，自然冷却。,2、染色,初染：在固定好并已冷却的涂片标本上滴加结晶紫染
3、液，要盖满涂膜。约1分钟后，用细水流从玻片的一端把游离的染液洗去。媒染（增加染料与细胞的亲和力）：滴加卢戈碘液数滴，作用1分钟后，轻轻水洗。脱色：在玻片上加95%乙醇23滴，并轻轻转动玻片数秒钟，使玻片倾斜让乙醇流去，如此重复数次，直至流下的乙醇几乎无色或稍成淡紫色，流水冲洗。复染：滴加稀释复红染液数滴，作用12分钟后流水冲洗。,3、结果判定,染色完毕，用吸水纸将标本片吸干，玻片上滴加香柏油，油镜观察。注意观察菌体的形态、大小、排列和染色。,五、注意事项,1、决定革兰染色成败的关键是脱色程度。若脱色过度，即使是G+菌，其蓝紫色也会被脱去而染上红色，被误认为是G-菌（假阴性）。若脱色不足，即使G
4、-菌也因蓝紫色被保留而染不上红色，被误认为G+菌(假阳性)。脱色程度又受脱色时间、涂片之厚薄、脱色时载玻片摇晃的快慢及酒精用量多少等因素的影响，无法严格规定。一般可用已知G+菌和G-菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰反应时，应同时另作一张已知G+菌和G-菌的混合涂片，以资对照。,五、注意事项,2、涂片以薄而匀为佳，切不可浓厚。过于密集的菌体，因脱色不均匀常呈假阳(阴)性。镜检时，要以分散开的细菌着色为准。3、做革兰染色的菌种，以培养1824h为宜。一般情况下G-菌的染色反应较稳定，不易受菌龄的影响；而G+菌,有的在幼龄时呈阳性，培养24和48h以上，由于细胞老化或死亡也可变为阴
5、性反应。4、不宜使用放置过久的碘液，以免影响固定结晶紫的作用。,六、作业,绘图：油镜下观察到的细菌及染色状况。革兰染色结果记录,七、思考题,1、试比较革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁结构的特征？2、革兰染色有什么实际意义？3、当你对一株未知菌进行革兰染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？,附表：革兰氏染液配制,1.草酸铵结晶紫染液A液：结晶紫（甲紫）2.0g+95%酒精20mlB液：草酸铵0.8g+蒸馏水80ml混合A液、B液，静置48小时后使用2.卢戈氏碘液碘片1.0g+碘化钾2.0g+蒸馏水300ml(先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成)3.95%酒精4.番红复染液 番红（沙黄，碱性藏红花）2.5g+95%酒精 取上述配好的番红酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成,
