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1、第一章：菌种与种子扩大培养 微生物工业用菌种 种子扩大培养 影响种子质量的主要因素,第一节 微生物工业用菌种一、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,二、工业化菌种的要求,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,生产特性要符合工艺要求,放线菌（链霉素四环
2、素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,1、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：,三、已工业化产品生产菌的介绍,2、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,氨基酸生
3、产菌的要求：,代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,3、食品酶制剂生产有关的微生物,开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,四、菌种分离与保藏,1、菌种分离的一般过程,土样的采取,预处理,培养,菌落的选择,产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性
4、实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,2、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签：地点、时间、气候等,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。,3、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,定向培养的方法,物理方法：加热、膜过滤等，表2-2（P31）,但主要是通过培养的方法,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温
5、度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,4、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素（P35）,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285
6、个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002),65-72,培养基中含0.05%of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落,5、目的微生物富集方法的研究进展,分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等,目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。,2002
7、,陈文新（科学院院士）,In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lipase
8、s from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.,FEMS Microbiology Reviews 26(2002)7381,六、菌株选育与分子改造,目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,方法,基因突变：,自然选育、诱变育种,基因重组：,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化：,点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等,自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-810-9,自然突变有两种情况：,一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰
9、退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。,另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。,1、自然选育,自然选育在工业生产上的意义,自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。,回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变,问题：,高产菌株是正突变高，还是负突变高？,自然选育操作步骤：,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落(注意形态的观察),发酵试验,2、诱变育种,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种,诱变剂：能够提高生物体突变
10、频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理在：紫外，快中子,化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍,（2）、诱变剂处理过程中几个有关的问题,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,诱变剂的选择,出发菌株的选择,（1）、诱变剂的作用原理（略）,压硝酸：0.07MNa2HPO4亚硝基胍：1MNaOH,（3）、诱变育种的一般步骤(p83),（4）、筛选的方法,随机筛选,形态,理性化筛选,从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。,结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能
11、，但细胞不能以其作为自身的营养物质。,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性：Lys的类似物AEC,Thr的类似物AHV,营养缺陷型：如Thr缺陷型,黄色短杆菌F9-50的诱变谱系,Bervibacterium flavum As 1.495(leu-)lys.HCl 2.1 g/l,F6-16(leu-,Thr-)20.8 g/l,F9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l,3、基因的直接进化(directed evolution),突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传,步
12、骤：,在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。,七、生产用菌种的保藏与复壮（一）、菌种保藏1、概念：根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使其代谢活动处于不活泼状态。2、不同情况、不同菌种采用不同方法。斜面低温保藏法（如酵母菌）石蜡油封保藏法（如酵母菌）砂土保藏法（如放线菌）硅胶保藏法冷冻干燥保藏法（如一般细菌）液氮超低温冻结法（如真菌）,（二）、防止菌种衰退的措施（1）、菌种的衰退发酵力的下降繁殖力的下降发酵产品的得率降低（2）、衰退的原因菌种保藏不妥菌种生长的要求没有得到满足 遇到不利的条件 失去某些必要的条件发生回复突变,（3）、防止衰退的方法做
13、好菌种的保藏工作尽可能满足生长条件尽量减少传代次数（4）、菌种的分离复壮普通方法：稀释平板法或平板划线法分离单细胞菌落芽孢杆菌：先将菌液沸水处理数分钟，再用平板进行分离改变培养条件：如单细胞分离仍效果不佳，可考虑改变培养温度条件，以利高产菌株生长而不利低产菌株生长 返回,第二节 种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,工业微生物的培养类型,种子制备的技术概要及种子制备实例,影响种子质量的因素,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,一、种子扩大培养的目
14、的与要求,种子扩大培养的概念:,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,二、工业微生物的培养类型,返回,三、影响种子质量的因素,（一）、种子制备的过程,（一）、种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,（二）、实验室阶段
15、,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细的控制。,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培养基的原
16、料一般都比较精细。,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。,子瓶:大量繁殖，得到大量孢子。接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。,孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月。,孢子培养,不产孢子的细菌如谷氨酸棒杆菌和短杆菌，采用斜面营养细胞保藏法，23月移种1次,产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种如灰色链霉菌和卡那霉菌，可将孢子接入液体培养基中形成菌丝体种子。,（三）、生产车间阶段,1、培
17、养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化,例：柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5%20%NH4NO3 0.225%0.11%K2HPO4 0.03%MgSO4.H2O 0.025%0.025%KCl 0.015%琼脂 2%
18、,薯干粉,成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 薯干粉 10%22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂 2%,3、发酵级数的确定,谷氨酸：二级发酵,摇瓶一级种子（小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子（发芽罐）二级种子（繁殖罐）发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,链霉素：四级发酵,一级种子 二级种子三级种子发酵,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,4、接种量的确定,移入种子的体积接种量 接种后培养液
19、的体积,过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。P 147,5、种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,接种种龄对碱性蛋白酶产生的影响,接种量对碱性蛋白酶产生的影响,6、温度,大多数微生物的最适生长温度：2537,不同生长阶段的微生物对温度的反应不同。,原则：延迟期处于最适生长温度，对数生长期略低于最适生长温度，后期主要决
20、定于溶解氧。,Q10:在生物学范围内，温度每升高10，生长速度加快1倍。,7、pH值,pH值的作用：影响菌体本身的生命活动；影响酶合成方向。,培养过程中发酵液的pH值会发生变化。,高碳源培养基倾向于向酸性pH值转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH值转移，变化总结果取决于碳氮比。,8、通气和搅拌,通气量与菌种、培养基的性质及培养阶段有关。,不同微生物要求通气量不同，同一菌种在不同生理时期对通气量要求不同,培养罐深、搅拌转速大，通气管开孔小或多，培养基粘度小，氧的溶解度大，反之则小。,9、泡沫,泡沫形成的原因：机械搅拌和通气使液体分散和空气窜入；代谢活动产生的气泡。,泡沫的危害：影响氧的吸收和二氧化
21、碳的排出；降低发酵罐的有效容量；导致跑料和染菌。,消泡措施：机械消泡，化学消泡。,10、染菌的控制,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,11、种子的质量要求：,量：要求达到一定的浓度,质:形态（生长处于某个阶段、均匀等等）理化指标：C、N、P的含量，pH 酶活等,无污染,四、种子制备过程举例,（一）、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,1、斜面(AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5
22、琼脂 2%，,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,2.一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,3.二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,
23、种子的质量要求：,108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列时结束，活力旺盛,（二）、青霉素生产的种子制备,制备过程,安培管,斜面孢子,大米孢子,一级种子,二级种子,发酵,1、斜面孢子,培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天,注意湿度50%左右,2、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4、二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,
