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1、实验七 微生物的分离与纯化技术,土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中。,从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。基本原理是选择适合于待分离微生物生长的条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧的要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。,一、实验目的和内容,目的：
2、学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。内容：1 培养基的配制及相关物品的灭菌；2 用稀释法从土壤中分离微生物；用平板划线方法分离微生物,二、实验材料和用具,牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏1号固体培养基，土豆蔗糖固体培养基，99mL无菌水(带玻璃珠)，9mL无菌水，10%酚液，土壤样品无菌培养皿、1mL无菌移液管、天平、称量纸、药勺、试管架高压灭菌锅,三、操作步骤,（一）固体培养基的配制（人一组）l 称量和溶解 2pH调节、分装（三角瓶）、包扎。3.灭菌,(二)土壤稀释分离（人一组）1取土壤 取表层以下510cm处的土样，放入无菌的袋或瓶中备用，或放在4冰箱中暂存。,2制备稀释液(要无菌
3、操作)(1)准备三角瓶装99mL水（加玻璃珠），1只；试管装4.5mL无菌水，；包扎、灭菌 角匙一只（2）制备土壤悬液：无菌角匙称土样1g，迅速倒入带玻璃珠的99mL无菌水瓶中(玻璃珠用量10粒左右)，振荡510min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。,在每根无菌移液管的报纸套上做好标记，如10-3、10-4、10-5。无菌移液管用前从中间拆开报纸套，取出移液管，用后再插回报纸套，保护移液管尖端。每次吸取土液，要将移液管插入液面，以口吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。放土液操作时移液管尖不能接触下一稀释度液体的液面，每一个稀释度换用一支移液管。,(3)稀释：用
4、无菌移液管吸10-2的土壤悬液1mL，放入9mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-310-的稀释液。,3.平板接种培养 3.1稀释倾注平板法(混菌),细菌:取10-6、10-7两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。取冷却至50（以不烫手为宜）的牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15ml)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。,倒平板时要注意无菌操作。,放线菌 取10-4、10-5两管稀释液各1mL，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿。取冷却至50（以不烫手为
5、宜）的高氏1号培养基（添加10%酚数滴），分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成放线菌平板。霉菌取10-4、10-5两管稀释液各1ML，分别接入相应标号的平皿，每个稀释度接两个平皿 取冷却至50（以不烫手为宜）的土豆蔗糖培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底为宜，约10-15mL)，迅速摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成霉菌平板。,倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用右手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖
6、在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约10mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。,3.2 平板划线分离法。倒平板 按无菌操作要求，在火焰旁操作，倒固体培养基平板。划线分离 使用接种环，挑取-土壤悬液，在平板中划线分离。划线的方法多样，目的是获得单个菌落。,用接种环以无菌操作挑取-土壤悬液，先在平板培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线。,掌握好力度，不要划破培养基。,4培养 将接种好的平板倒置，即皿盖朝下放置，(可减少培养基水分蒸发、可减少污染)，培养细菌：37，恒温培养箱中培养12d。培养放线菌：28，恒温培养箱中培养35d。培养霉菌：28，恒温培养箱中培养35d。,四、结果,观察从土壤稀释分离的微生物菌落,菌落特征描述菌落特征包括大小，形状，隆起形状，边缘情况，表面状态，表面光泽，质地，颜色，透明度等。,粘质沙雷氏菌,细菌菌落,青霉的菌落,观察结束，清洗培养皿。,
