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1、1,第二章 微生物的代谢调控及应用,第一节 微生物的代谢调节第二节 代谢的控制及应用,2,第一节 微生物的代谢调节,代谢调节部位酶合成的调节酶活性的调节微生物代谢调节的模式能荷调节次级代谢与次级代谢调节,3,微生物的新陈代谢错综复杂 参与代谢的物质多种多样 同一种物质也会有不同的代谢途径各种物质的代谢之间存在着复杂的相互联系和相互影响。,微生物代谢调节体系严密、精确、灵敏，可有序而高效运行，并能灵活地适应外界环境，最经济地利用环境中的营养物。微生物的代谢调节具有多系统、多层次的特点。,4,一 代谢调节部位（调节方式）,微生物的代谢调节主要通过养分的吸收排泄、限制基质与酶的接近和控制代谢流等几个
2、部位实现的，在这方面真核生物与原核生物略有区别，主要表现在前者有各种各样的细胞器。,5,其中以调节代谢流的方式最为重要，它包括两个方面，“粗调”，即调节酶的合成量，“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。,6,二 酶合成的调节,酶合成的调节是通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、也是缓慢的。酶合成的调节主要有两种类型：酶的诱导和酶的阻遏。,7,诱导(Enzyme induction),按照酶的合成与环境影响的不同关系，可以将酶分为两大类，一类称为组成酶(Structural enzym
3、es)，它们的合成与环境无关，随菌体形成而合成，是细胞固有的酶，在菌体内的含量相对稳定。如糖酵解途径(EMP)有关的酶。另一类酶称为诱导酶(Inducible enzyme)或适应性酶，只有在环境中存在诱导剂(Inducer)时，它们才开始合成，一旦环境中没有了诱导剂，合成就终止,8,诱导酶：在对数生长期的大肠杆菌(E.coli)培养基中加入乳糖，就会产生与乳糖代谢有关的-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶等。这时，细胞生长速度和总的蛋白质合成速度几乎没有改变，这种环境物质促使微生物细胞中合成酶蛋白的现象称为酶的诱导。,培养基中加入乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成,9,2 酶合成的阻遏(Enzyme rep
4、ression),在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶称为阻遏酶(repressible enzyme)。阻遏的生理学功能是节约生物体内有限的养分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代谢产物阻遏和分解代谢产物阻遏两种类型,10,末端代谢产物阻遏,由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏称为末端代谢产物阻遏。通常发生在合成代谢中，特别是在氨基酸、核苷酸和维生素的合成途径中十分常见。生物合成末端产物阻遏的特点是同时阻止合成途径中所有酶的合成,1
5、1,直线式代谢途径，末端产物阻遏情况较为简单。如大肠杆菌中 甲硫氨酸是由高丝氨酸经胱硫醚和高半胱氨酸合成的，在仅含葡萄糖和无机盐的培养基中，大肠杆菌细胞含有将高丝氨酸转化为甲硫氨酸的三种酶，当培养基中加入甲硫氨酸时，这三种酶消失,甲硫氨酸反馈阻遏大肠杆菌的蛋氨酸合成酶的合成(R)：表示反馈阻遏,12,当细胞内同时存在两种可利用底物(碳源或氮源)时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。现在知道，这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏。,分解代谢物阻遏(Catabolite repression),13,分解代
6、谢物阻遏过去被称为葡萄糖效应,培养基中不同糖对大肠杆菌生长速度的影响1.单独加入葡萄糖时，菌体生长几乎没有延迟期；单独加入乳糖时，菌体生长有明显的延迟期；2.同时加入葡萄糖和乳糖时，菌体呈二次生长,14,三.酶活性的调节,通过改变酶分子的活性来调节代谢速度的调节方式称为酶活性的调节。与酶合成调节方式相比，这种调节方式更直接，并且见效快。是发生在蛋白质水平上的调节。,15,调节酶:某些酶的活性受到底物或产物或其结构类似物的影响，这些酶称为调节酶。激活 前馈 抑制 反馈 前馈作用一般是激活酶的活性。在分解代谢中，后面的反应可被较前面反应的中间产物所促进.如:粪链球菌(Streptococcus f
7、eacalis)的乳酸脱氢酶活性可被1,6-二磷酸果糖所激活；在粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)培养时，柠檬酸会促进异柠檬酸脱氢酶活性。,16,在微生物代谢调节中 更常见的是反馈调节，尤其是末端产物对酶活的反馈抑制。调节酶的抑制剂通常是代谢终产物或其结构类似物；效应物的作用是可逆的，一旦效应物浓度降低，酶活性就会恢复。调节酶常常是催化分支代谢途径一系列反应中第一个反应的酶，这样可避免不必要的能量浪费。,17,四.微生物代谢调节的模式,在微生物合成代谢过程中，反馈阻遏和反馈抑制往往共同对代谢起着调节作用，它们通过对酶的合成和酶的活性进行调节，使细胞内各种代谢物浓度保持在适当的水平
8、。反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快前者的作用往往会影响催化一系列反应的多个酶后者往往只对是一系列反应中的第一个酶起作用,18,直线式代谢途径的反馈控制 大肠杆菌的异亮氨酸合成途径（首先发现）,苏氨酸是合成异亮氨酸的前体 给苏氨酸缺陷型大肠杆菌补充苏氨酸时，该菌株可以合成异亮氨酸，若同时添加异亮氨酸，就不能利用苏氨酸合成异亮氨酸了。原因：异亮氨酸抑制了由苏氨酸转化为异亮氨酸途径的第一个酶，即L-苏氨酸脱氨酶.,19,大肠杆菌中由氨甲酰磷酸和天门冬氨酸合成胞嘧啶核苷三磷酸(CTP)时需要七种酶，当CTP达到一定浓度后，便反馈抑制催化第一个反应的酶，即天门冬氨
9、酸转氨甲酰酶。,大肠杆菌CTP合成途径中的直线式反馈抑制,20,分支代谢途径的反馈控制,由几种末端代谢产物共同对生物合成途径进行控制的体系较为复杂。即便是同一代谢途径，不同菌种也会有不同的控制模式。这些控制可以是反馈阻遏或反馈抑制单独作用的结果，也可以是两者共同作用的结果。,21,大肠杆菌合成苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸中的同工酶调节E表示末端产物反馈抑制；R表示末端产物反馈阻遏,22,五.能荷调节,能荷指细胞中、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节也称腺苷酸调节，系指细胞通过改变ATP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动。它们所含能荷依次递减，上述三者在细胞中的含量不同，
10、表明细胞的能量状态不同。,23,巴斯德效应 在厌氧条件下,向高速发酵的培养基中通入氧气,则葡萄糖消耗减少,抑制发酵产物积累的现象称为巴斯德效应。即呼吸抑制发酵的作用。1861年在研究酵母的酒精发酵量和氧分压之间的关系中发现的，故称巴斯德效应 现在，人们将在厌氧型和需氧型能量代谢之间的转换过程总结为巴斯德效应。,24,次级代谢是某些生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，其生产能力常受金属离子的影响。通过次级代谢合成的产物称为次级代谢产物，如抗生素、毒素、色素、激素等。目前由微生物产生的抗生素大约有6000多中，其中有4500种产生由放线菌。,
11、六.次级代谢与次级代谢调节,25,微生物的代谢产物,26,次级代谢的调节,酶合成的诱导调节反馈调节碳、氮分解调节磷酸盐调节细胞膜透性调节,27,1.碳、氮分解代谢物调节,指能迅速被利用的碳源（氮源）及其分解代谢物，对其它代谢中的酶的调节。例如:葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、卡那霉素等都有明显降低其产量的作用。,28,2.磷酸盐的调节,高浓度的磷酸盐：较强的抑制作用抗生素等次级代谢产物的合成浓度在0.3300mmol/L：支持细胞的生长 10mmol/L及以上：抑制许多抗生素的物合成调节机制：有的是通过抑制酶的作用，有的是导致细胞能荷变化，提高磷酸盐竞争某些必需金属离子的作用,2
12、9,3 细胞膜透性的调节,在青霉素发酵中，产生菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低。若输入硫化物能力增大，硫源供应充足，合成青霉素的量就增多。,30,第二节 代谢的人工控制及应用,工业发酵的目的就是大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。在正常生理条件下,微生物总是通过其代谢调节系统最经济地吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物。人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓代谢的人工控制。主要是通过遗传学和生物化学方法来实现的,31,一.遗传学的方法,通过改变微生物遗传物质可以从根本上打
13、破微生物原有的代谢控制机制，具体包括应用特定的营养缺陷型突变株、渗漏突变菌株、抗反馈调节的突变株、抗分解代谢突变株以及组成型突变菌株。,32,1.营养缺陷型突变株的应用 对于直线式代谢途径，选育末端代谢产物营养缺陷型的突变株只能积累中间代谢产物。如末端产物E对途径第一个酶有反馈阻遏或反馈抑制，而菌株失去了将C转化成D的力，是E的营养缺陷型。假如在培养基中限量添E，菌体得以生长，中间产物C能够大量积累。谷氨酸棒杆菌的精氨酸缺陷型就是一个典型例子,鸟氨酸积累量可达到25克/升。,33,34,对于分支代谢途径而言，情况比较复杂。如图所示，分支途径因E和G对途径第一个酶有协同反馈控制，而突变株失去了将
14、C转变成D的能力，产物E无法正常生成,从而解除了E和G的协同反馈控制。若培养基中限量补充E和G，就会造成中间产物F的积累,35,突变株是E和G双重缺陷型，因而需限量添加E和G,36,末端产物E和I对途径第一个酶有协同反馈控制作用，突变株失去了将C转变成F的能力，所以，它也是双重营养缺陷菌株。如果培养基中限量添加G和I，可以积累末端产物E.,37,赖氨酸、苏氨酸：合作反馈抑制天冬氨酸激酶 天冬氨酸：除合成赖氨酸外，还作为合成苏氨酸和甲硫氨酸的原料。因此，正常的细胞内难以积累较高浓度的赖氨酸。赖氨酸生产：选育谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷型作为赖氨酸的发酵菌种。该菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶(HSD
15、H)，故不能合成高丝氨酸，也不能合成苏氨酸和蛋氨酸，在补充适量高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)条件下，菌株能大量产生赖氨酸,38,青霉素与初级代谢产物赖氨酸是同一分支代谢途径的两个产物。它们的共同前体是-氨基戊二酸。赖氨酸对合成-氨基戊二酸的酶有反馈阻遏或抑制作用，赖氨酸达到一定浓度后，阻止-氨基戊二酸的合成，也阻止了青霉素的合成。选育赖氨酸营养缺陷型，解除赖氨酸反馈调节，同时，也切断了通向赖氨酸的代谢支路，使大量生成的-氨基戊二酸用于青霉素的合成。,39,2.抗反馈控制突变株的应用 抗反馈控制突变株就是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼而有之的菌株。在这类菌株中，反馈调节已经解除，所以能
16、大量积累末端代谢产物。抗反馈抑制突变株可以从结构类似物抗性突变株和营养缺陷型回复突变株中获得。,40,添加了结构类似物的培养基就象一个筛子，可以将解除了反馈控制的突变株筛选出来。这些与末端代谢产物结构类似的化合物会干扰正常菌体的代谢，甚至引起菌体死亡，所以又称为抗代谢物。,41,42,许多氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的结构类似物已用于氨基酸、核苷、核苷酸和维生素高产菌株的育种工作。,43,3.渗漏突变菌株的利用,渗漏缺陷型的利用 这是一种不完全的营养缺陷型，它不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节。但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成。这样在培养这类突变体时，可不必在培养基中添加相
17、应的物质，就能积累所需的产物了。,44,4.抗分解代谢阻遏突变株,通过突变可以获得抗分解代谢阻遏的突变体。如果这种突变体是用于葡萄糖分解途径的，则该类突变体具有缓慢利用葡萄糖的能力，结果是使整个系列的酶去阻遏。,45,5.组成型产生菌的应用,在发酵工业中，要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的，分批限量加入诱导物在工艺上也多不便，更为有效的方法是改变菌株的遗传特性，除去对诱导物的需要，即选育组成型突变株。突变可以除去酶合成时对诱导物的依赖。这样：组成酶突变抹在没有诱导底物存在时，也能照常合成诱导酶。在生产中使用组成酶突变株时，可不必在发酵液中添加诱导物，而且它们产生的诱导酶活性也比原菌株强，
18、其优点是显而易见的。,46,二、生物化学方法 添加前体绕过反馈控制点 不通过遗传学方法也能改变菌株的调节机制，采取添加前体绕过反馈调节点是一种有效的方法，能使某种代谢产物大量积累。如图，在发酵培养基中添加C，可以大量积累D。其原因是D的前体C来自外源，并不会因为D的积累而有很大的波动。由于F对从C到E 的反应有反馈调节，所以，只有少部分的C 用于合成F，大部分外源的C用于合成D。,47,色氨酸生物合成中,终产物对色氨酸代谢途径的第一个酶有强烈的反馈抑制作用，使色氦酸的合成受阻。而邻氨基苯甲酸是色氦酸合成的一个前体，仅参与色氨酸的最后阶段的合成，如果在发酵中加入邻氨基苯甲酸，虽然色氨酸对第一个酶
19、的反馈抑制仍然在，但对由邻氨基苯甲酸合成色氨酸并无影响，使色氨酸的合成可以不断进行，从而大幅度提高了发酵产量。,48,添加诱导剂 诱导酶只有在诱导剂存在时才形成，因此，在培养基中加入诱导剂，可以大量合成这类酶。从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，如大肠杆菌-半乳糖苷酶的最有效诱导剂是异丙酰-D-硫代半乳糖苷，它不被-半乳糖苷酶分解。高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也会引起分解代谢物的阻遏。,49,几种酶的诱导物,50,因此，对于许多工业发酵生产胞外酶的过程来说，如果以高浓度底物为诱导剂，产量反而不高。用底物的衍生物做诱导剂，因为利用速度缓慢，可以消除分解代谢物的阻遏，显著
20、提高酶的产量。例如利用蔗糖单棕榈酸酯代替蔗糖作诱导剂可以使双孢拟内孢霉的转化酶产量提高约80倍。,51,此外，酶合成的调节还受反馈调节和分解代谢物的调节，受分解代谢物的酶类如下表所示:,52,发酵与分离过程耦合 反馈调节的启动因素就是超过菌体正常需求量的末端代谢产物，也就是说，只有末端代谢产物的浓度超过一定值后，菌体的反馈调节机制才会发挥作用。如果我们在发酵的同时就将末端代谢产物不断地移走，使发酵体系中末端代谢产物的浓度始终处于较低的水平，那么菌体内代谢途径将始终畅通无阻。与发酵过程耦合的分离手段很多,有膜分离、双水相萃取。,53,控制细胞膜的通透性 细胞内代谢产物常以较高浓度积累在细胞内，并
21、反馈控制它的进一步合成。采用生理学方法，可以改变细胞膜通透性，使细胞内代谢产物迅速渗透到细胞外，消除反馈控制，有利于提高发酵产量。,54,生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，该酶催化乙酰CoA的羧化生成丙二酸单酰CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此，只要控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的通透性，影响到代谢产物的分泌。如油酸、表面活性剂、甘油。,55,在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的积累有明显的影响，只有把生物素的浓度控制在适量情况下，才能大量分泌谷氨酸。当生物素含量为2.5mg/ml时，谷氨酸的产量最高，继续增加生物素，谷氨酸产量反而下降。当
22、生物素含量较高时，添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶活性，结果引起其结构中肽桥间无法交联，造成细胞壁缺损，这有利于代谢产物渗漏到胞外。,56,遗传学方法也能用于改变细胞膜的通透性。应用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型菌株，在限量补充油酸的培养基中，因为油酸是细菌细胞膜磷脂中重要的脂肪酸，油酸缺陷型突变株不能合成油酸而使细胞膜缺损,使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。,57,控制发酵的培养基成分：碳源分解调节 氮源分解调节 磷酸盐调节,58,避免使用有阻遏作用的碳源和氮源 在积累经验之后，一些发酵可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖
23、、多元醇、有机酸和黄豆饼粉等。举例：用甘露糖代替半乳糖来培养萤光假单胞菌由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了1500倍。流加碳源或氮源 考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不致于产生阻遏。如果缓慢流加葡萄糖，也能使产量提高200倍左右。,59,小测验一1、发酵工业的兴起，成功建立起深层通气培养法及整套工艺2、我国发酵食品工艺的特色在哪些方面？3、可通过哪些手段或调控方法实现微生物代谢产物积累？,60,作 业,简述发酵与酿造和生物技术的关系 查找最近几年代谢控制发酵的产品或相关技术（要求：3-4个同学一组，查找后组织材料，做成幻灯片，五张以下，推选同学讲）,
