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1、1,荧光分析法,现代表征方法与技术-,Fluorescence Analysis,2,荧光分析法第三版 许金钩、王尊本主编，科学出版社,参考书,Principles of Fluorescence Spectroscopy(II、III),J.R.Laowisz,Kluwer Academic/Plenum Publisher,一、分子荧光的产生过程二、荧光的产生与分子结构的关系 三、影响荧光强度的因素,第一节 分子荧光原理,Principle of Fluorescence,一、仪器与结构流程二、激发光谱与荧光光谱三、荧光分析法和应用,第二节 分子荧光分析法,Fluorescence Ana
2、lysis,5,一、荧光的产生过程 Luminescence Process of Molecular Fluorescence,*分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级；*基态激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；*激发态基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；,1.分子能级与跃迁,6,2.电子激发态的多重度,*大多数有机分子的基态处于单重态；*电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向 M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；*根据洪特规则，平行自旋（三重态
3、）比成对自旋（单重态）稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；,S0T1 属于禁阻跃迁，需要通过其他途径进入，而且进入的几率小；,7,3.激发态基态的能量传递途径,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。,9,非辐射能量传递过程,振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使
4、荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。,10,辐射能量传递过程,磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁）；,电子由S0进入T1的可能过程：,发光速度很慢：10-410 s，即光照停止后，可持续一段时间。,荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级基态（S1 S0跃迁）10-710-9s,（S0 T1禁阻跃迁）,11,速率竞争决定光活化电子能量迁移的途径！,荧光的光物理本质,12,二、荧光的产生与分子结构的关系 Relation Between Fluorescence and Molecular Structure,1.荧光量子产
5、率,荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；,kF主要取决于化学结构，而Ski则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。,大多数荧光物质的量子产率在0.11之间。,13,2.有机化合物的结构与荧光,（1）跃迁类型：*的荧光效率高。这是因为*跃迁的摩尔吸收系数比 n*大，且*跃迁的寿命比n*要短。（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。,（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子效应。,14,1
6、5,强荧光物质往往具备以下特征：,具有大的共轭 p 键结构；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态S1为p p*型取代基团为给电子取代基,小结：,16,1.荧光强度和溶液浓度的关系 荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即：If=K(I0-I)由朗-比耳定律：I/I0=10-b c代入，得：If=KI0(1-10-b c)将此式展开，即,三、影响荧光强度的因素,低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。,浓度很低时，ebc 0.05，则可近似写成：If=2.3 I0 l c=Kc 定量分析的基础,17,2.溶剂的影响 溶剂的介电常数
7、越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光减弱；溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。3.温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加,从而导致荧光强度的下降。,影响荧光强度的外部因素,18,4.溶液pH 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；,有荧光,无荧光,无荧光,有荧光,pH13 无荧光,19,自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。,碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因。,5.荧光的熄灭,氧的熄灭作用等。,浓度越大、温度越高，碰撞机会越大,粘度越大，碰撞
8、机会越小,20,一、仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。特点：（与UV-vis仪器的比较）有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,两个单色器分别是：1）选择激发光波长的第一单色器2）选择发射光(测量)波长的第二单色器,21,22,检测器：光电倍增管。,样品池：,材料：与UV-vis吸收池 相同。,形状：,？,光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区),氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：200700nm,在200400nm波段内，光谱强度几乎相等。,23,仪器光路图,24,二、激发光谱与荧光光谱 Excitation S
9、pectrum and Fluorescence Spectrum,If ex(固定 em),1.荧光的激发光谱曲线,2.荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）,If em(固定 ex),25,粗步设定ex，扫描 em,萘的激发、荧光光谱,ex,em,相对强度,固定em（最佳），扫描ex,固定ex（最佳），扫描 em,荧光（发射）光谱曲线I,I,荧光激发光谱曲线 II,荧光（发射）光谱曲线 III,II,III,26,3.激发光谱与发射光谱的关系,(1)Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。(2)发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不
10、同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。,27,4.测定波长的选择,瑞利散色和拉曼散色,28,三、荧光分析方法与应用,1.特点（1）结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少，应用范围广。（4）灵敏度高 分析物浓度范围：10-5 10-8 mol/L，检测下限：0.10.1g/cm-3 比紫外-可见分光光度法高24个数量级。,29,定性方法 任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的
11、基础。定量方法 If=2.3 I0 b c=Kc,2.定性、定量方法,30,3.荧光分析法的应用,(1)无机、有机化合物的分析 在紫外光照射下能产生荧光的无机物极少，难以利用其自身的荧光来进行测定。通常采用与有机试剂形成配合物后测量，或通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。目前可测量元素已有约60多种。,31,32,但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素B2强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。,尿液中维生素B2的测定,维生素B2（核黄素）在430-440 nm 蓝光照射下会发出绿色荧光，em为535 nm。它在
12、pH 6-7 的溶液中荧光强度最大，而在pH 11时荧光消失；,33,荧光法测定抗坏血酸,34,35,(2)生物、医学研究,内源荧光与外源探针,36,蛋白荧光,37,膜探针,38,核酸探针,39,分子灯标（molecular beacons）,40,分子传感器（molecular chemosenors）,41,荧光共振能量转移（FRET）系统,42,GFP是一种在395nm的激发光下可以释放出绿色荧光的蛋白，现已广泛的应用于生物以及医学研究。该蛋白可以表达在真核细胞中，在和其他基因融合表达的情况下，可以活体示踪目的蛋白的定位以及活动.,通过跟踪发出的绿光来观察病毒在宿主体内的扩散途径；或者把
13、GFP接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动,从水晶水母体内第一次分离出荧光基因,日裔科学家下村修1962年首先在水母中发现GFP,Martin Chalfie(沙尔菲)指出GFP的发光特性在生物示踪方面有极高价值；,商业用途：荧光鱼,改造后的GFP可发射其它颜色的荧光，允许科学家一次性跟踪一种以上的蛋白质。图片中美丽的“彩虹”就是大脑中的神经系统网络。,华裔科学家钱永健改造了GFP，使得它可以在不同的激发光下发红蓝等各色，并且更加易于使用，大大扩展了此类蛋白的应用。,45,Fluorescence research,Key word:Fluorescen*Period:Jan/2005-Jun/2005Data base:美国化学会(ACS)数据库 3566 篇 WPS电子期刊全文数据库 206 篇SDOS全文数据库（上交 镜像）1890 篇英国皇家化学会（RSC)数据库 120 篇研究与应用领域涉及：生命 环境 材料 等,46,
