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1、高效液相色谱的维护与保养,液相色谱仪器的使用及保养,色谱泵的保养,流动相要过滤常用缓冲液时，停泵前要用水冲洗，并用水冲洗柱塞杆清洗孔拧紧排液阀时，不要太用力，以不渗液为准更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡.例如:使用无机盐缓冲液时,用前和用后均须用水过渡,流动相的脱气,流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化,加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤
2、的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度在线脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度,流动相脱气的方法,色谱泵的排气操作,使用前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：将排液阀反时针转2-3圈，用10ml注射器抽，直到出液按以下方法之一将泵的后面放空将U6K的C阀打开，或717设在PURGE状态或，将参比阀打开或，把色谱柱摘下打开电源开关开大流速到 69ml/min同时用10ml注射器从排液阀注入流动相直到泵后的流速稳定无气泡为止,色谱泵的运行,注意用外部控制器与用泵面板控制的区别有些型号的外部控制器与面板不能同时用如需要面
3、板控制，需要断开控制线或关闭控制器排气后的色谱泵即可运行注意排气后，先设流速为 0恢复排气时断开的部分，如进样器、色谱柱如需要，恢复排气时断开的控制线根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度防止细菌的生长,溶剂的相溶性,流动相的保存,有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止长菌有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,测试条件水样:40ml trace enrichmen
4、t 2.0 ml/min色谱柱:C18 反相柱(Waters)梯度:线性 100%水 100%乙腈波长:254 nm,保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水,测试条件水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱:C18 反相柱(Waters)梯度:线性 100%水 100%乙腈波长:254 nm,检测器的保养,如长时间不用检测器可以关掉紫外灯在4小时以上不用时，太频繁开关也不好不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗示差检测器及荧光检测器注意流动池的耐压，不要在后面加压,关于自动进样器的针清洗,Purge Injector 与 Needle Wash洗针溶剂瓶(绿色塑料
5、管)不要放在自动进样器的上部，应放于自动进样同一水平面洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：,液相色谱系统的清洗与钝化,一般采用30磷酸作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜,测柱效 良好的色谱实验习惯,拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录色谱测试条件定期检测柱效定期检测仪器的谱带展宽,测柱效的方法,色谱柱种类繁多,性能各异,测定方法亦各不相同基本上所有的色谱柱均附有“使用与维护说明书”,可按说明书所述方法测定以下是Waters反相C18柱的测定方法:流动相:乙腈/水=6
6、0:40;流速:1ml/min样品:50mg Acenaphthene(二氢苊)溶于100ml乙腈,加入600l丙酮进样量5l检测波长:254nm,计算色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式：W 方法Wtan16切线法Wh 5.54 半峰高W39 3W416 4W525 5,色谱柱的正确使用及操作,流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度：0.1ml/min凝胶柱（GPC及糖柱）温度的变化幅度专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱与仪器的联接,不同公司的色谱柱接头不同。处理不当时会造成严重后果：色谱峰展宽（死体积）致使柱效下降或渗漏解决办法：自制相应的转换接头使用“通用”型接头（锥箍及螺母）
7、这种锥箍在不锈钢管上是活动的，即stop-depth长度可调。因此可以换接不同的色谱系统及色谱柱。从Waters Phase Separations公司能得到一些PEEK工程塑料的接头,可用在各种类型的色谱柱上。,色谱柱的联接,各种锥箍和管路接头长度示意图:,色谱柱安装及连接的机械因素,连接不妥，造成漏液,连接适当,连接不妥,由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽，机械问题,谱带展宽,色谱柱的在线保护装置,给色谱柱提供物理的保护除去样品及流动相中的颗粒给色谱柱提供化学的保护防止分析柱被化学污染装置在线过滤器自装填料保护柱预装保护柱,In-Line Filter防止颗粒在色谱柱头累积优点：基本不影响柱
8、效在需要高柱效的分析时中常用（如：氨基酸分析）可更换的消耗品更换滤芯更换垫圈,色谱柱的在线保护装置,保护柱,可避免化学污染新型保护柱可提高整个色谱柱的柱效，甚至可作为色谱柱使用保护柱选择：选用与色谱柱相同的填料真正起到保护作用保证色谱分离结果,使用保护柱延长色谱寿命实例：磺胺药物分析,色谱柱的保护,使用配Symmetry C8保护柱的色谱柱：首次进样,相同保护柱与色谱柱：第950次进样,更换新Sentry Guard保护柱：第951次进样,对所做的样品要有充分的了解用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗硅胶柱的一般方法先用甲醇洗去极性杂质用干燥的二氯甲烷、正庚烷100200ml依次活化键合相柱(烷
9、基)的一般方法20倍柱体积的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次冲洗若使用缓冲液，需先用不含盐的水溶液清洗,色谱柱的清洗,色谱柱的存放,存放前的处理除去杂质、缓冲盐合适的存放溶剂避免色谱柱床的干涸避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度,正确使用色谱柱（一）,流动相方面除去微粒纯度的要求-超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低-缓冲液的pH值，在填料的允许范围内-缓冲液（盐）的浓度-溶剂：色谱纯，并与填料相匹配-溶剂中的杂质含量流动相对样品的溶解度-有机溶剂或水的比例,正确使用色谱柱(二),色谱柱的在线保护装置,色谱柱的存放,启动液相色谱仪器的流程,常见问题分析,基线噪音,可能的原因：,检测池脏,检测池灯
10、能量下降,由泵引起的脉冲,检测器上的温度效应,检测池中有气泡通过,Time(min.),基线漂移,梯度洗脱引起的,温度不稳定（RID）,流动相脏,柱子没有用流动相平衡,系统中污染物溢出,鬼峰,20%-100%MeOH梯度洗脱没有进样,鬼峰没有进样就有色谱峰出现。,原因流动相脏,60,15,30,15,0,3,7,15,17,柱外扩展,用较短的、窄内径的毛细管连接进样器和色谱柱以及柱子和检测器。,确认连接管的接头都相互匹配。,使用死体积小的流动池,减小进样量,增加柱外死体积,峰形,柱头塌陷或柱床运动。,泵头过滤芯(Frit)部分堵塞。,组份共流出,1双峰,正常,双峰,柱头塌陷,峰形,2峰扩展,所有峰都扩展,柱效降低或有柱塌陷,进样体积过大,流动相粘度大,部分峰扩展,前一次分析样品的流出物,高分子量样品蛋白质或聚合物,峰形,原因：,部分峰拖尾,正常,拖尾,正常,拖尾,二次保留效应,残留硅醇的相互作用,小峰在大峰后洗脱出来,3拖尾,对称因子1.2,柱头有污染物堆积,重金属反应,所有峰均拖尾,柱外效应,柱子失效,峰形,原因,正常,负峰,样品吸收比流动相吸收小。,5负峰,溶解样品的溶剂通过柱子时平衡被破坏,RID中最常见,
