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1、第五节 蛋白质结构与功能的关系,一、一级结构与功能的关系,蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。,1、同功能蛋白质一级结构的种属差异与分子进化,同功能蛋白质：不同生物体中表现同一功能的蛋白质，又称同源蛋白质。,对比不同生物的同源蛋白质的氨基酸序列可以发现，它们长度相同或相近，而且许多位置的氨基酸是相同的。这些相同的氨基酸残基称为不变残基。不变残基对于同源蛋白的功能是必需的。,其它对于不同种属有相当大变化的残基称为可变残基。根据可变残基能推测生物种属间在系统发生上的联系。同源蛋白质的氨基酸序列的相似性称为顺序同源性。,生物 与人不同的AA数目 黑猩猩
2、0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、10 狗、驴 11 马 12 鸡、火鸡 13,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 与人不同的AA数目 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,根据细胞色素 C的顺序种属差异建立起来的进化树,2、一级结构的变异与分子病,分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病，称为分子病。,镰刀状红细胞贫血病,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-
3、A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,镰刀形红细胞,正常红细胞,2、空间结构与功能的关系,核糖核酸酶的变性与复性,一级结构是空间构象的基础,天然状态，有催化活性,尿素、-巯基乙醇,去除尿素、-巯基乙醇,非折叠状态，无活性,Anfinsen实验,肌红蛋白与血红蛋白的结构与功能,目 录,肌红蛋白(Mb)由153个氨基酸残基组成,血红蛋白(Hb)的亚基有141个氨基酸,亚基有146个氨基酸残基。Mb and Hb的两种亚基氨基酸残基数和序列均有变化，但它们的三级结构几乎完全相同。说
4、明肌红蛋白和血红蛋白的亚基和亚基都起源于一个共同的祖先。,在血红蛋白和肌红蛋白分子中与辅基血红素相连的氨基酸都是组氨酸。说明不同氨基酸序列中只有关键的氨基酸不变才能产生相同的构象，执行相同的功能。这种关键氨基酸通常提供形成蛋白质构象的必要基团。,肌红蛋白和血红蛋白的每条链都含一个血红素辅基。血红素由四个吡咯环构成的原卟啉和一个铁离子组成。作为亚铁离子，可形成6个配位键：其中4个与卟啉与环的氮原子连接，第五个与His93相连，第六个与氧可逆结合附近有个His64辅助氧的结合。,血红蛋白与氧结合的协同性,肌红蛋白与血红蛋白都能与氧结合，但肌红蛋白是单体蛋白而血红蛋白是四聚体蛋白。,血红蛋白氧饱和度
5、,在溶液中血红蛋白分子上已结合氧的位置数与可结合氧的位置数之比称为饱和度（saturation)。,肌红蛋白氧饱和度,Mb和Hb的氧合曲线比较,Hb的输氧功能,Mb的储氧功能,血红蛋白与氧结合的分子机制,脱氧血红蛋白亚 基间的交联键,第六节蛋白质的性质,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）,蛋白质电泳,蛋白质在溶液中解离成带电颗粒，在电场中可以向与其电荷相反的电极移动，这种现象称为：电泳,不同种类的蛋白质由于
6、等电点的不同，在一个指定pH条件下所带电荷的性质和多少也不相同，加上它们分子量大小、颗粒形状的不同，因此在电场中移动的方向和速度各不相同。根据这一原理可用此方法对蛋白质进行分离和分析。,1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。,聚丙烯酰胺凝胶电泳 既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。,PAGE垂直平板电泳示意图,聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应：浓缩效应 分子筛效应 电荷效应,蛋白质胶体性质,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和
7、性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,蛋白质胶体性质的应用,透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。,透析与超过滤简易装置,蛋白质的分子量及其测定,蛋白质的相对分子量很大，一般在104106或更大。蛋白质的分子量除了根据其化学组成来测定外，主要是利用蛋白质的某些物理化学性质来测定。,1、沉降速度法,是利用超速离心机测定蛋白质相对分子量的一种方
8、法。将蛋白质溶液放在超速离心机的离心管中进行超速离心。60 00080 000rpm.使蛋白质分子沉淀下来，当蛋白质的分子大小和形状相同时下沉速度也会相同，在离心管中产生一个明显的界面，利用光学系统可以观察到此界面的移动，从而测定蛋白质的沉降速度。,超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,离心机结构示意图,转头,转头腔,沉降样品,驱动马达,真空,冷冻,沉降系数(sediment
9、ation coefficient,S),一种蛋白质在单位离心力场里的沉降速度。常用S（Svedberg unit)表示。,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,已测得许多蛋白质的S值都在110-1320010-13之间，因此，采用110-13S作为沉降系数的一个单位。例如：某蛋白质的沉降系数为3010-13S，可用30S表示。,由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量：M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 i:蛋白质的偏微比容：溶剂的密度,2、凝胶过滤（又称分子筛层析）,
10、是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。原理是：使用葡聚糖凝胶（商品名Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名Sepharose）。该凝胶具有网状结构，网孔大小用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比例来实现。这些网孔只允许较小的分子进入珠内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时被排阻的大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。,交联葡聚糖（Sephadex）,凝胶过滤法,当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo出来，无分配。当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。当0kd1时，Ve=Vo+kdVi,各溶质具不同分配，得以分离。,3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,
11、相对迁移率：蛋白质分子的移动距离与前沿物质移动距离的比值。,相对迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈直线关系。,蛋白质的沉淀,如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀方法类别:1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）2、酸硷（等电点沉淀）3、有机溶剂沉淀 4、重金属盐类沉淀 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀 6、加热变性沉淀,盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。,2.
12、盐溶和盐析 盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层，使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。,3.有机溶剂沉淀法 a 有机溶剂（与水相溶）争取蛋白质颗粒上的水 膜，使之沉淀。b 有机溶剂：乙醇、丙酮 c 低温操作，边加入边搅拌，防止局部过热，引 起变性，尽量缩短处理时间。,蛋白质变性与复性,蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部
13、原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。,表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变 应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老,蛋白质复性,蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。,蛋白质的紫外吸收光谱,蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征
14、吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,测定范围：0.10.5mg/ml,蛋白质主要呈色反应,双缩脲反应 酚试剂反应 蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法,双缩脲反应,蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物,红紫色络合物,(硷性溶液),Cu2+,第七节 蛋白质的分类,结合蛋白质,根据组成分类,简单蛋白质,简单蛋白质分类,结合蛋白质分类,一、蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的一般原则 提纯的目标：尽量提高蛋白质的纯度或比活性，设法除去变性的和不需要的蛋白质，尽可能提高蛋白质的产量。根据蛋白质的性质加以选择，如分子大小，溶 解度、电荷、吸附性质及生物亲和力等。
15、,第八节 蛋白质的分离纯化,1、从组织细胞中溶解放出蛋白质，并保持天然状态，常用低温冰冻、化学试剂及溶菌酶破壁、破膜，再用溶剂提取。2、分离所需要蛋白质与其他蛋白质 a 等电点沉淀 b 盐析和有机溶剂分级分离 纯化：a 离子交换层析 b 凝胶过滤层析 c 亲和层 析 d 电泳方法,一般程序：,3、结晶提纯 a 多次结晶，除杂蛋白和变性蛋白 b 结晶的最佳条件：略过饱和溶液 各步骤要求条件温和，并加少量杀菌剂。防止蛋白质变性、蛋白质酶作用及微生物污染。,问答题,1、为什麽说蛋白质是生命活动最重要的物质基础？2、试比较Gly、Pro与其它常见氨基酸结构的异同，它们对多肽链二级结构的形成有何影响？3、试举例说明蛋白质结构与功能的关系（包括一级结构、高级结构与功能的关系）。4、为什么说蛋白质水溶液是一种稳定的亲水胶体？5、什麽是蛋白质的变性？变性的机制是什麽？举例说明蛋白质变性在实践中的应用。,名词解释等电点（pI）肽键和肽链 肽平面及二面角 一级结构 二级结构 三级结构 四级结构 超二级结构 结构域 蛋白质变性与复性 分子病 肽,
