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1、1,第七章 蛋白质折叠和分子伴侣,2,7.1 蛋白质和新生肽链折叠的新概念,DNA RNA 蛋白质（新生肽链）新生肽链必须经历一系列极其复杂的加工过程，包括氨基酸残基的化学修饰诸如二硫键的形成、糖基化作用、羟基化作用、磷酸化作用等。现在已知的与翻译同时进行或在翻译完成后进行的化学修饰反应已经超过100种。新生肽链必须进行折叠，才能形成一定的三维结构。每一个新合成的多肽链都必须转运到细胞内特定的场所或者被分泌到细胞外区发挥作用。这些转运往往需要经过一次甚至多次的跨膜过程。完全折叠好的蛋白质是不能跨越细胞膜的，因此如果折叠过早或过多，还要先去折叠，才能跨膜运输到特定的发挥其生物功能的场所，再最终折
2、叠成为功能蛋白。,3,多亚基蛋白还要进行亚基的组装。许多以前体形式合成的蛋白，如一些蛋白酶等还必须经过水解除去前体分子中的原序列和前序列才能转变成具有活性的酶分子新生肽只有折叠成特定的三维结构，才能获得特定的生物学功能，成熟为功能蛋白分子。新生肽的折叠不仅指肽链在空间的盘卷，而是包括广义的新生肽链的整个成熟过程，包括化学修饰、跨膜转运、亚基组装、水解激活等。,4,20世纪50年代FraekelConral和Williams从烟草斑纹病毒分离的外壳蛋白和核糖核酸，在体外生理条件下重组得到有感染活力的病毒粒子。60年代 根据还原变性的牛胰核糖核酸酶在去除变性剂和还原剂后，不需要任何其他物质的帮助，
3、能够自发的形成正确的4对二硫键，重新折叠成天然的三维结构，并恢复几乎全部生物活性的实验，提出“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必须的全部信息”或者说“一级结构决定高级结构”的著名论断，为此Anfinsen 获得1972年Nobel化学奖。这些经典的工作开辟了近代蛋白质折叠的研究，形成了蛋白质折叠自组装（selfassembly）的主导学说。,5,Anfinsen 原理揭示了蛋白质的氨基酸序列决定蛋白质分子在热力学上稳定的三维结构的必然，但是没有阐明蛋白质折叠的全过程，还有些问题需要回答：一级结构到底如何决定高级结构？具有完整一级结构的多肽链又如何克服在动力学上可能的能障，
4、最终达到这个热力学上最稳定的状态？是否存在像三联遗传密码那样的第二套密码，即氨基酸序列决定蛋白质的三维结构的所谓的“折叠密码”？,6,7.1.1 蛋白质折叠的研究,按照Anfinsen原理，在理论上应该可以根据蛋白质的氨基酸序列预测其相应的“唯一”的三维结构，进而进行蛋白质的结构预测具有重要的意义。近年来的研究表明蛋白质折叠是一个序变过程，实验的目的是通过捕捉蛋白质折叠的中间状态了解蛋白质折叠的全过程。在研究牛与人的乳清蛋白酸变性、热变性和在中等浓度盐酸胍溶液中变性时的各种物理性质，发现在这些条件下都能形成一种彼此类似但又不同于天然分子的结构，具有与天然蛋白不同的新的物理状态“熔球态”熔球态是
5、蛋白质折叠过程的中间态，与天然分子比较，虽然被动性增加，不存在特定的牢固安排的侧链基团，但其结构仍是紧密的，并且具有显著的分子柔性，二级结构含量很高。,7,对大多数小分子量蛋白质来说，变性的蛋白质在没有外力的情况下可以通过折叠达到天然状态无序状态的瓦解(疏水坍塌，collapse）和二级结构的形成。重折叠一开始很快形成二级结构，但是处于不稳定状态。二级结构的稳定阶段多途径折叠。不同蛋白质二级结构单元的联合和装配方式不同，即通过多途径导致从变性态转变为天然态走向天然态。通过稳定二级结构的相互作用进入天然态，是折叠的最后过程，比早期过程慢。在这一阶段，侧链被包装在特定的位置，分子变得越来越紧密，成
6、为有特定三维结构和生物学功能的蛋白质分子,8,对于蛋白质的折叠，提出了几种模型，比较典型的有框架模型（framework），扩散碰撞模型（diffusioncollision）和熔球态模型（molten globule）等等,9,成核/快速生长模型(Thenucleation/r apidgrowthmodel)伸展多肽链开始折叠时,多肽链上先形成许多小的“核”(nuclcus),这些小核由8-18个氨基酸残基组成,它们随机波动,很不稳定,多肽链的其它部分以“核”为模板,快速折叠“生长”,最终形成天然构象,在这个模型中,成核阶段(nucleation)是限速步骤。,10,拼图模型(Thejig
7、sawpuzziemodel)此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠,在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多,最终都能形成天然构象,而且沿每条途径的折叠速度都较快,与单一途径折叠方式相比,多肽链速度较快,另一方面,外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响,而对具有多条途径的折叠方式而言,这些变化可能给某条折叠途径带来影响,但不会影响另外的折叠途径,因而不会从总体上干扰多肽链的折叠,除非这些因素造成的变化太大以致于从根本上影响多肽链的折叠。,11,扩散-碰撞-缔合模型(The diffusion-collision-adhesion mode
8、l)多肽链在折叠起始阶段迅速形成一些类天然结构或称“微结构域”(micro-domain),如-helices,-strands等,这些结构在伸展的多肽链中不稳定,它们之间相互碰撞相互作用而结合在一起时,这些“微结构域”就稳定下来,多肽链进一步折叠形成天然构象。,12,框架模型(The framework model)在多肽链折叠过程中,先迅速形成二级结构,这些二级结构也是不稳定的,称为“flickering cluster”,多肽链在二级结构的基础上再进行组装,形成三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域(sub-domain)是折叠中间体
9、的重要结构。,13,快速疏水折叠模型(Therapidhydropho-biccollapsemodel)伸展多肽链处在极性的水溶液环境中,其疏水侧链基团为避开极性环境而导致多肽链快速折叠,形成“溶球体”(moltenglobule),然后再进一步折叠形成天然构象。,14,动力学模型(Thekineticmodel)多肽链折叠分为三个阶段，在多肽链折叠的起始阶段类似“拼图模型”,多肽链沿多条途径迅速形成许多具有一些局部结构的中间体,折叠的中间阶段类似“成核/快速生长模型”的快速生长阶段,多肽链在第一阶段形成的局部结构的基础上进行快速折叠“生长”形成具有较多天然结构的中间体,复性的最后阶段是中间
10、体向天然构象的转变,这是整个折叠过程中的限速步骤。,15,蛋白质折叠动力学模型U1-6:伸展多肽链I1-3:具有局部结构的中间体I4:具有较多天然结构的中间体NN:天然构象,16,这些模型各有特点,这与模型提出者们各自研究的对象及侧重点不同有关,它们之间有许多相似之处,如“框架模型”与“扩散-碰撞-缔合模型”中各自所指的“微结构域”和“flickering cluster”型“和”成核/快速生长模型”的一些观点。为在多肽链的始阶段,“疏水折叠”和二级结构的形成(框架模型)就是互补的,它们在多肽链折叠的起始阶段可以同时存在。因为在“溶球体”中就有大量的二级结构。,17,除了这些折叠模型外,还有学
11、者从另外的角度来考虑多肽链在体内快速折叠的问题,如Karplus等用Monte Carol法对200个随机序列的折叠动力学进行了研究,发现其中30种能快速折叠,而其中146种折叠速度很慢。他们认为,在生物进化过程中,自然界容易选择那些能快速折叠而最终达到热力学上稳定结构的序列,而那些折叠缓慢的多肽链在生物体内容易被蛋白酶降解而被自然界淘汰。,18,另外,多肽链在体内的快速折叠显然是由生物体内这个特殊的生理环境所决定的,折叠过程受到许多酶的催化,如蛋白质二硫键异构酶(PDI),脯氨酰顺反异构酶(PPI)等,分子伴侣在这个过程中也会起到重要作用,多肽链在体内折叠还可能是伴随着翻译/转移进行的。Be
12、rgman,L.W.和.发现免疫球蛋白轻链的Cys35-Cys100这对天然二硫键是伴随着多肽链的翻译及向内质网转移的过程中形成的，说明多肽链N端部分在翻译还未完成时就可能开始折叠,这显然也是多肽链在体内快速折叠的一个原因。,19,以变性蛋白的重新折叠作为新生肽链翻译完成后折叠的模型来研究新生肽链的折叠是建立在过去几十年间在体外研究蛋白质折叠基础上的。长期以来普遍认为细胞中新合成的多肽链是在其合成终了之后，不需要别的分子的帮助，也不需要额外能量的补充，就应该能够自发的折叠而形成它的三维结构，是一个翻译后的自发折叠过程。所以，是一条完整的但还不具有高级结构的新生肽链的自发折叠。,20,普遍的用天
13、然蛋白先变性使其丧失高级结构而成为伸展的肽链，再去除变性因素使其自发的重新折叠，即把变性蛋白的复性作为新生肽链折叠的模型。所以蛋白在试管内的去折叠和重新折叠的研究一直是蛋白质折叠研究的主体系统，也是研究新生肽链折叠的基本模型。,21,邹承鲁在1988年提出了新生肽链折叠的假说，他认为新生肽链的折叠在合成早期业已开始（取决于特定蛋白分子氨基端的氨基酸序列），而不是合成完成后才开始进行的；随着肽链延伸同时进行折叠，又不断进行构象的调整；先形成的结构会作为后合成的肽链的折叠，而后形成的结构又会影响前面已经形成的结构的调整，因此在肽链的延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样新生肽链
14、的合成、延伸、折叠、构象调整，直到最终三维结构的形成，是一个同时进行着的、协调的动态过程。显然这与一条变性伸展的完整肽链的重折叠的情况是完全不同的。,22,新生肽链边合成边折叠边调整的假说，将国际上有关新生肽链折叠的多种看法统一起来，强调了新生肽链折叠的结构信息存在于组成多肽链的氨基酸序列中，既考虑到多肽链中特定氨基酸残基间的近程相互作用，又重视特定氨基酸残基的远程相互作用在新生肽链折叠中的重要贡献。,23,新生肽链在合成过程中一直与核糖体相连，并且每种肽链在核糖体上的衍射是不同步的。每个mRNA可以同时携带多个核糖体，因此也带着多个处于不同合成阶段的、长度不同的新生肽链。我们现在还没有有效的
15、手段来探测肽链在核糖体上的折叠过程。多肽链在核糖体上合成同步化等问题尚未解决之前，邹承鲁实验室提出用从N端开始具有不同长度的一系列肽段做模型，比较研究它们的构象变化和折叠规律。,24,二维及多维核磁共振为进一步研究新生肽链的折叠过程提供了精确的定量和定位方法。已有的结果表明，核糖体上的肽段的二级结构的含量并不总是随着肽链的延长而增加，说明后形成的肽段对先行成的肽段的构象确实有影响，肽段的结构一直处于调整之中。,25,将多肽链延伸过程中构象的形成和生物活性的表达一起考虑时，即可进一步阐明在新生肽链延伸过程中构象的形成和活力出现之间的关系。对不同长度的肽段的去折叠和重新折叠特性以及它们同其特定配体
16、结合特性的研究，可以进一步探明肽段的延伸和多肽链上特定氨基酸残基之间相互作用的关系以及对生物活性的贡献。利用构象特异的单克隆抗体与不同长度的肽段之间相互作用的特性，也可以探测多肽链延伸过程中其特定构象形成的过程。,26,以核酸酶为例实验研究表明，肽链上作为抗原决定簇的特定区域在核酸酶折叠的早期已经出现，此时肽链的折叠结构含量低。随着肽链的继续延伸，较长片段的折叠结构含量显著提高，此时与构象特异性单克隆抗体的结合能力显著降低，这是由于与较短片段相比，较长的片段具有更多的二级结构，结构较为紧密，符合前熔球态的结构特性。更长的肽链则具有更为丰富的二级结构，分别为熔球态，后熔球态和类天然态，在这些较长
17、片段中抗原决定簇被部分包埋或屏蔽，导致抗体不易接近。,27,当整条肽链的合成完成后，肽链的结构含量表现为最高，而它与构象特异的单克隆抗体的结合能力表现为最低，这表明肽链上作为抗原决定簇的特定区域在蛋白折叠完成后，已较少暴露在该蛋白的表面，同时也说明在由类天然态蛋白延伸到天然蛋白的过程中，肽段构象仍有较明显的变化上述结果充分说明核酸酶在肽链延伸直至形成完整的功能蛋白的过程中经历了多次构象调整。,28,对同一种蛋白质的不同长度的N端肽段的结构与功能表达关系的研究为了解新生肽链的折叠机制提供了很多有意义的结果和佐证，但毕竟是在离体条件下研究新生肽链折叠的模型体系。进一步探索新生肽链在核糖体上折叠的设
18、计相继问世，如将构象特异性的单克隆抗体作为探针，探测肽链在核糖体上延伸过程中的构象变化过程。另一种办法是将体外转录与体外翻译相结合，设计各种探针来追踪体外翻译体系中酶蛋白活性表达过程来探测新生肽链在核糖体上的折叠过程。,29,7.1.2 体外蛋白质重折叠与细胞内新生肽链折叠的差别,完整肽链在试管内的重新折叠相当于翻译完成后才折叠；细胞内新生肽链的合成延伸与折叠同时进行细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。哺乳动物细胞的温度大约在37附近，pH值一般在中性范围内。蛋白质复性如果在体外这样的条件下进行，通常会形成大量的聚集物，活性蛋白的回收率多半是极低的。为了得到高产率的复性，往
19、往降低温度到4，复性蛋白的浓度也很低，通常大约在1mg/ml。针对不同的蛋白，体外折叠所选用的pH值范围也很不同。,30,细胞中存在着成千上万种生物大分子，细胞质内所有大分子的浓度估计可高达50-400mg/ml，因此，细胞容积的1040都被大分子占用。如，根据生长期的不同，大肠杆菌细胞质中蛋白质和RNA的总浓度约在300-400mg/mL范围内。由于大分子的不可穿透性使得任何一个大分子的实际可使用空间大大减小，这样生物大分子活动环境被称为“大分子拥挤环境”它对生物大分子行为的影响描述为“排斥容积效应”（excluded volume effect），强调的是源于空间排斥的纯物理的非特异性效应
20、，因此把研究的大分子以外的其他大分子成为背景大分子（background macromolecules）。而且大分子拥挤环境在细胞外也是存在的。,31,大分子拥挤最早是在理论上进行研究的，NIH的从1983年就开始研究大分子拥挤现象，从理论上预测这样一个大分子拥挤环境对所有大分子之间的反应都有很大的影响，不仅反应的速率而且影响反应的平衡。最近Warwick大学的教授指出，生物学家们在研究体系中一定要加入细胞内相应浓度的“拥挤试剂”（crowding agent）以模拟细胞内的大分子拥挤环境；要把大分子拥挤与pH、离子强度和溶液组成等一样视为常规因素考虑在蛋白质折叠的研究中。,32,近期以来,体
21、外模拟大分子拥挤对蛋白质折叠反应的平衡及反应动力学的研究较多。Zimmerman和Minton建立了不同的反应模型系统,通过系统反应测试大分子拥挤环境对反应速率和反应平衡的影响。结果表明,加入大分子拥挤试剂后,不仅加快了反应速率,而且使得平衡向着结合的方向移动。已占体积理论认为,高浓度的惰性大分子可以巩固稳定致密的蛋白质的天然状态。建立了一个更为详细的模型以解释这种效应提高惰性大分子的浓度,可以降低解折叠多肽链的含量并最终导致平衡向着形成蛋白质天然结构的方向移动。,33,当溶液中的蛋白质浓度增加,拥挤效应对活性系数的影响远比对浓度的影响要大的多。于1983年就发现,将血红蛋白的浓度从20g/L
22、升高到30g/L时,其活性系数增加了10倍。同时,拥挤效应对活性系数的影响还和参与的蛋白质的构型熵有关,拥挤环境限制了蛋白质相互反应过程中的构象变化。已占体积效应可以很好的解释在拥挤环境条件下的蛋白质折叠过程中的同源聚合反应和异源聚合反应。Ralston和Cole通过实验发现,给反应体系中加入聚蔗糖Dextran或聚乙二醇PEG,可促进血影蛋白从其二聚体形式向四聚体形式转变。Linder和Ralston也发现血影蛋白二聚体与四聚体之间的平衡受到了拥挤的影响,拥挤增加了缔合速率常数。1999年,Rivas等人发现,在高浓度的牛血清白蛋白BSA溶液中(40g/L),血纤维蛋白原单体(其与BSA之间
23、不会发生异源聚合)倾向于形成二聚体甚至形成更大的寡聚蛋白。,34,然而,拥挤也会引起部分折叠蛋白质之间的相互聚合从而降低了部分折叠蛋白质转变成为天然功能蛋白质的数量。VandenBerg等人关于大分子拥挤对蛋白质折叠的影响的报道认为,拥挤体系加强了非天然蛋白质之间的聚合程度。在大分子拥挤环境中,和已占体积效应对非天然蛋白质命运的决定影响力相比,蛋白质与拥挤试剂之间的异源聚合反应在蛋白质的再折叠过程中发挥了重要作用。实验采用的复性缓冲体系含有300g/L的拥挤大分子,拥挤大分子分别采用聚蔗糖Dextran70,葡聚糖Ficoll70,牛血清白蛋白BSA。以还原型溶菌酶作为测试对象,分别测定其在不
24、同拥挤试剂条件下的复性产率,得到的结果表明复性产率显著降低。,35,通过实验发现,分别以多糖和蛋白质作为拥挤试剂,结果有很大的区别:蛋白质BSA的影响要比多糖Dextran70及Ficoll70的影响严重的多。尽管BSA,Ficoll70,Dextran70有着近似的分子量,但是,它们在缓冲体系中所引起的对还原型溶菌酶的排阻体积效应很可能不同。BSA为球型的蛋白质,而Ficoll70或Dextran70为无交联结构或部分交联结构。其次,BSA具有17对二硫键,那么在完全还原的溶菌酶的再折叠过程中,BSA可能会和还原型溶菌酶上的巯基形成错配的分子间二硫键。BSA和溶菌酶形成的中间体的结构仍然还是
25、未知,但是溶菌酶是一个碱性蛋白质,很容易和酸性的蛋白质如BSA发生反应。,36,总之，大分子拥挤是普遍存在的,各种类型的细胞中都有发生。所以有机体进化了机理以保证新合成的多肽链在高度拥挤的环境中能够正确折叠。一方面,分子伴侣和折叠酶可以帮助多肽链在高度拥挤的环境中正确折叠;另一方面,多肽链本身具有折叠信息以应对大分子拥挤。不同的蛋白多肽链获得不同的应对高度拥挤环境的能力。,37,7.1.3 蛋白质折叠研究的新概念,20世纪80年代后期，分子伴侣（molecular chaperone）的发现使新生肽链自发折叠和组装的传统概念发生了很大的变化。现在认为，细胞内新生肽链折叠和成熟为功能蛋白，一般说
26、来是需要帮助的，而不都是能自发进行并完成的。该观点在动力学的意义上有所发展，加深和完善了蛋白质折叠的学说。如果一级结构是肽链折叠形成功能蛋白质的特定三维结构的内因是第一要素；那么帮助蛋白质肽链正确折叠的外因是条件，外因要过内因起作用；但如果没有适当的充分的条件，多肽链也不能折叠成为活性蛋白质。,38,7.2 帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子,帮助新生肽折叠的是蛋白质，它可以分为两大类：分子伴侣催化与折叠直接有关的化学反应的酶“折叠酶”，目前已确定的帮助蛋白质折叠的酶只有两个，一个是蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI）；另一个是肽基脯氨酸酰顺反
27、异构酶（peptidy prolyl cistrans isomerase，PPI）。它们都催化共价的异构反应。,39,7.2.1 分子伴侣（molecular chaperone）,1978年Laskey发现，必需要在一种核内酸性蛋白nucleoplasmin存在时，组蛋白和DNA在体外生理离子强度条件下才能组装成核小体，否则就会发生沉淀。Laskey给帮助核小体组装的蛋白起名“molecular chaperone”。后来Ellis在研究高等植物叶绿体中的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco）时也发现类似现象。在叶绿体中合成的8个大亚基核在细胞质中合成的8个小亚基都必须先和一种
28、蛋白结合后，才能在叶绿体内组装成活性酶分子。因此，1987年Ellis证实提出在普遍意义上帮助新生肽链折叠的“molecular chaperone”的概念。,40,经几度修正，1997年Ellis对“分子伴侣”的定义是：A large and diverse group of unrelated proteins that all share the functional property of assisting the noncovalent assembly and/or disassembly of protein-containing structure in vivo,but a
29、re not permanent components of these structures when they are performing their normal biological functions.即一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久的组成成分。分子伴侣完全是从功能上定义的。,41,从参与促进一个反应而自身并不在最终产物中出现这一点来看，分子伴侣具有酶的特征。酶与分子伴侣的不同表现在如下三个方面：1.分子伴侣对靶蛋白布局有高度专一性，同一分子伴侣可以促进多种氨基酸序
30、列完全不同的多肽链折叠成三维结构、性质和功能都并不相关的蛋白质 2.分子伴侣的催化效率很低 3.分子伴侣和肽链折叠的关系，有时也只是阻止肽链的错误折叠，而不是促进其正确折叠成为成熟的有完整功能的蛋白质,42,已经鉴定的部分分子伴侣,43,44,分子伴侣帮助正确的“非共价组装或卸装”强调“非共价”是为了区分和排除那些催化新生肽进行翻译后共价修饰的酶。Ellis在1993年年时曾明确指出：“蛋白质二硫键异构酶不是分子伴侣”。王志珍等对此持有不同的看法：提出了一个假说“蛋白质二硫键异构酶既是酶又是分子伴侣”。并且提供了充分的实验证据证明蛋白质二硫键异构酶确实具有固有的，在一般意义上的分子伴侣活性，进
31、一步又证明蛋白质二硫键异构酶作为折叠酶的作用是由异构酶活性和分子伴侣活性二者共同组成的。,45,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,hsp60,hsp60,hsp60,46,用“组装”这个词，是因为分子伴侣的功能不仅帮助新生肽链折叠，还帮助新生肽成熟为活性蛋白的各个步骤，包括转运，跨膜定位，亚基组装以及激活等，因此用广义的“组装”比较妥当，由于新生肽链越膜有时需要解折叠，错误折叠的肽链由蛋白水解酶清除前也需解折叠，分子伴侣还有帮助卸组装的作用。另外，分子伴侣的作用还涉及许多其他正常的生命活动，如DNA 复制；细胞受到外界刺激（高温、缺氧、有害化学因素、异常代谢物积聚、极端pH
32、等)后的应激反应。,47,蛋白质分子折叠的特点和分子伴侣在蛋白质分子折叠中的作用,蛋白质分子的三维结构，除了共价的肽键和二硫键，还靠大量极其复杂的弱次级键的共同作用形成的。现在认识到，变性蛋白的复性或新生肽链的成熟，不是一步形成的，而是通过形成一些折叠中间物而完成的。特别是新生肽链在逐渐延长过程中序列的不完整性使这些折叠中间物有可能形成在最终成熟蛋白分子中不存在而且不应该有的瞬间结构。它们常常是一些疏水性的表面。这些瞬间形成的错误表面之间就有可能发生本来不应该发生的错误的相互作用而形成没有活性的分子，特别是在拥挤的细胞环境中，甚至会造成分子的聚集和沉淀。,48,49,蛋白质分子具有分子伴侣功能
33、的先决条件是具有与多肽结合的能力。分子伴侣的作用机制实际上就是它如何识别需要帮助的靶蛋白，怎样与其结合，结合后二者发生什么变化，在什么条件下解离，解离后二者的命运又如何这样一个全过程的机制？现在还认识得很少。对分子伴侣作用机制的认识由于1994 年细菌的GroEL的2.810-10m高分辨率晶体结构的解析而有所突破。现在只知道分子伴侣识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然的结构。一般而言，分子伴侣不是识别特定的多肽序列。到底非天然结构的什么特征能被分子伴侣认识还很不清楚。,50,由于在天然分子中，疏水残基多半位于分子的内部而形成疏水核，去折叠后就可能暴露出来，或者在新生肽
34、链的折叠过程中，会暂时形成在天然构象中本应存在于分子内部的疏水残基组成的表面，因此认为分子伴侣最有可能是与疏水表面相结合。在许多情况下，发现被分子伴侣结合的靶蛋白是处于所谓的“熔球体”结构即分子的三级结构已经部分破坏但二级结构仍然基本保存，因此整体结构表面看来尚还紧密实际上已经松散的一种状态。一般来说，分子伴侣与折叠早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合；一旦聚合已经形成，分子伴侣就无能为力了。,51,在活细胞内经常存在一种所谓级连机制，即一个新生肽链的折叠、转运和组装需要处于其成熟通道上不同部位的不同分子伴侣分级连续协同作用才能完成。比如在原核生物的核糖体上就有触发因子（trigger
35、 factor），古细菌可能与真核生物相似。在核糖体上有新生肽链结合复合体（nascent chainassociated complex）和prefolding防止尚未离开核糖体的新生肽链发生聚集。新生肽链从核糖体脱落下来后，在胞质内则可得到DnaJ-DnaK-GrpE的帮助,进一步还可得到GroEL或TriC家族的帮助而最终完成折叠。,52,分子伴侣还有一个非常重要的功能是与一些依赖ATP 的蛋白水解酶一起,负责对细胞内的蛋白质进行“质量控制”即对正在折叠的肽链或折叠好的蛋白质进行监控,把折叠错误的或因各种刺激损伤的无可救药的蛋白由蛋白水解酶清除，以防止垃圾堆积而引起疾病。有趣的是这些负责
36、清除无活性的蛋白垃圾的蛋白水解酶本身也具有固有的分子伴侣的活性（有的分子伴侣构成蛋白水解酶的亚基），所以这种蛋白水解酶发挥作用的前期可能就是利用分子伴侣活性识别应该被降解的对象，并使蛋白处于可溶状态而容易被蛋白水解酶作用。与水解作用相联的分子伴侣活性又称charonins，主要有3个家族Clp 家族、AAA 蛋白水解酶，如FtsH和Lon蛋白水解酶。,53,“质量控制”最重要的问题是分子伴侣如何识别，如何正确分配？哪些还能够继续折叠？哪些已没有希望继续折叠而必须被水解清除的？有一种所谓的“动态分配”观点认为“非天然构象的肽链”无论是正在折叠的肽链或受损伤的肽链，可以与体系中的分子伴侣或有分子伴
37、侣活性的蛋白水解酶相互作用而被进一步正确折叠或被水解，它也可能因逃逸这两种作用而发生自聚集。其最终命运则取决于这几种反应的相对速度。,54,7.2.2 蛋白质的聚集,近年来，发现了一些与当今人类健康和安全密切有关的疾病，如疯牛病，Alzheimers（早老痴呆症)、huntington氏症、Parkinson氏症等神经退行性疾病，是由于蛋白质形成聚集，并在特定器官中形成淀粉样纤维沉淀或斑块。因此蛋白质聚集，错误折叠的产物，反而成为蛋白质折叠研究中极其热门的重要的内容，已经发现大概有20多种蛋白，包括Prion 蛋白、-淀粉样蛋白Serpins、脂蛋白AI 等，形成与这些疾病有关的淀粉样沉淀。,
38、55,最近，在蛋白质聚集研究中的一个重要进展是剑桥大学的Dobson教授发现，与上述这些形成淀粉样纤维沉淀疾病无关的蛋白质在体外一定的条件下也能聚集而形成淀粉样纤维，这种由“普通”蛋白形成的淀粉样纤维与疾病中发现的淀粉样沉淀完全一样而不可区分。因此他们认为聚集是蛋白质多肽链的一个普遍性质，而不只是少数已确定引起有淀粉样纤维沉积的疾病的蛋白所特有，进一步他们通过对细胞功能损伤的测试指出，即使对非致病蛋白而言，其早期的聚集产物对细胞都是有极大毒性的，而那些已经成熟的、形成了高度有序的淀粉样沉淀倒对细胞基本上无害了。这些重要进展使人们对蛋白质聚集的认识提高了一大步。,56,蛋白聚集体的结构对疾病的发
39、生、发展要比蛋白的种类和一级序列更为重要。现在对这类疾病冠以各种名称“构象病”、“淀粉样纤维沉积病”、“折叠病”等等，其本质都是蛋白质的聚集。蛋白质聚集不仅如以前认为的只是丧失了蛋白的功能，其本身还对细胞有固有的毒性。因此在蛋白质生物合成的分子水平上防止蛋白聚集，提高正确折叠效率，挽救错误折叠的蛋白，对维持细胞正常功能是极其重要的。生物进化必然会造就相应的机制来保证蛋白质折叠的高效率，那就是分子伴侣、催化与泛素结合的酶系统以及蛋白水解酶，它们的协同作用保证长期正常的生命活动。,57,7.2.3 分子伴侣概念的推广,从Ellis 于1987年提出“分子伴侣”的新概念并予以定义以来，分子伴侣的范围
40、实际上一直在扩展而不拘泥于最早的定义。首先，分子伴侣不再局限于蛋白质（包括酶）；核糖体，RNA，甚至一些磷脂（lipochaperone）都被鉴定为有分子伴侣的活性。有一类蛋白稳定剂（如甘油和其他多元醇）它不提供结构信息，可能是通过增加蛋白的水化作用而稳定其结构从而提高折叠的效率也被称为“化学分子伴侣”。细胞中有一类有机小分子称为“细胞渗透物”（cellular osmolytes）帮助细胞对付诸如高渗那样的应激，也起着化学分子伴侣的作用。实际上，人们在研究包含体的复性时常常用到“化学分子伴侣”。,58,分子伴侣帮助的对象也不局限于蛋白质，分子伴侣也可帮助其他生物大分子的折叠。与DNA结合、帮
41、助DNA分子进行预折叠或预扭曲，从而把DNA稳定在一个适合于和蛋白结合的特定构象,帮助DNA折叠的称“DNA 分子伴侣”。最近还发现RNA 分子伴侣，即帮助RNA分子折叠的蛋白质。RNA 无论是其本身的加工、剪接和成熟，还是发挥各种生物功能，都与蛋白质的相互作用密切相关，都需要有一定的构象。RNA折叠存在两个基本问题：(1)在折叠过程中很容易发生错误折叠(2)它的三级结构不是非常稳定,很难确切描述。一些RNA 结合蛋白与其结合后可以防止RNA的错误折叠,或消除它的错误折叠从而促进RNA正确折叠成为功能结构，或把RNA稳定在正确的三级结构中。现在已经鉴定到许多蛋白，如核糖核蛋白、核蛋白壳以及依赖
42、RNA的ATP酶,都具有RNA分子伴侣的活性。,59,分子伴侣一定不是最终组装完成的结构在发挥其生物学作用时的组成部分，但不一定必须是一个分离的实体，它可以是共价地却是暂时地结合在靶蛋白上。因此一些蛋白水解酶的前导肽序列以及一些核糖体前体蛋白的泛肽尾，若有分子伴侣功能的也不排除在外，见下表。,60,前导肽对于这些酶的折叠和成熟是必需的，称为分子内分子伴侣（Intramolecular chaperone）。这些处于信号肽和成熟蛋白之间的前导肽，不仅抑制酶原蛋白的活力，现在认识到它们还有新的功能，即作为分子伴侣帮助酶原蛋白折叠。与一般的分子伴侣相比，这种分子内分子伴侣具有高度的专一性。通过不需要
43、ATP的自水解作用释放。通常分子伴侣对其帮助对象是不提供三维结构信息。但枯草杆菌蛋白酶的分子内分子伴侣似乎对其酶蛋白的折叠提供了结构信息。,61,7.2.4 分子伴侣的分类,1.伴侣素家族(Charperon in,Cpn)Cpn 家族具有独特的双层7-9元环状结构的寡聚蛋白(Hemm inngw en;cheng 1998),它们以依赖ATP 方式促进体内正常和应急条件下蛋白质折叠。Cpns 又可分为两组:GroEl(Hsp60)家族和Tric 家族。GroEl 的Cpn 由双层7个亚基形成圆环组成,每个亚基分子量约为60ku。它们在体内与一种辅助因子,如E.coli 中的GroES,协同作
44、用帮助蛋白质。这些蛋白质一般是应急反应诱导的,人们对GroE 和GroES的结构、功能及作用机理作了详细研究。Tric 型的Cpn 是由双层8 或9元组成,亚基分子量约为55k。该种Cpn 没有类似的辅助因子。,62,GroEL,GroEL的结构 GroEL 蛋白是同型寡聚复合物,由14 个相对分子质量58 103 的亚基组成,形成两层垛叠的背靠背双环组成的中空圆柱结构,每个环由7 个亚基组成。晶体学研究表明,GroEL 每个亚基由3 个结构域组成:顶端结构域(apical region)位于圆柱两端的顶端开口处,是底物和其辅助分子伴侣(cochaperonin)的结合位点;赤道结构域(equ
45、atorial domain)包括ATP 结合位点及大部分内环和外环的接触点,有微弱的ATP 酶活性;铰链结构域(hinge domain)是和别的结构域相连的地方,并在顶端结构域和赤道结构域间传递构象变化。在GroEL 的中央空腔中可结合多种非天然的多肽(nonnative polypeptide),底物结合主要靠非天然多肽暴露的疏水侧链和GroEL顶端结构域的疏水残基相互作用。GroEL 单独可以帮助某些底物折叠。,63,GroEl,64,同时使多肽也有机会离开GroEL 复合体,释放的多肽或者发生了去折叠,或者已经折叠,或重新结合相同或不同的GroEL 复合体,这样再结合可能诱导错误折叠
46、的多肽发生去折叠,最终保证了多肽的正确折叠。一般来说,GroEL 介导的蛋白质折叠需要GroES的协助。GroES 是由相对分子质量为10103 的亚基组成的单一七聚体环,并连在GroEL 的末端。,65,GroEL 的功能,在新生蛋白质的正确折叠和组装以及变性蛋白质的恢复过程中起重要作用。就GroEL-GroES 介导的蛋白质折叠,Jue等提出了两种在新生蛋白质的正确折叠和组装以及变性蛋白质的恢复过程中起重要作用模型:胶囊化模型(encapsulation model):在多核苷酸存在的情况下,GroES 可以顺式结合到多肽GroEL 二元复合体上,封住了多肽,提供了一个保护的环境,使蛋白质
47、不可能聚集,同时GroES 的结合诱导GroEL 构象发生了大的变化,使中央空腔体积加倍并且掩盖了疏水多肽结合区,刺激了多肽的折叠反应,当折叠持续约1530s后,ATP水解,释放GroES。,66,反复退火模型(interative annealing model):在非变性情况下,未折叠的蛋白质(Iuf)处于天然态或者误折叠中间体(Imf)。分子伴侣(无论是GroEL 还是其它小分子伴侣)结合到这些误折叠的蛋白质上,促进其解折叠,所以多肽又获得了达到天然态的机会。,67,在蛋白质跨膜转移或蛋白质插入E.coli 细胞质膜过程中起重要作用 Phillips等实验表明,在GroEL 功能缺陷的E
48、.coli 菌株中,分泌蛋白的输出受到损伤。根据荧光印迹结果分析，GroEL 的膜靶蛋白是SecA,SecA 是转运机制中的一个中心蛋白,SecA 和SecY形成蛋白质传导膜通道。GroEL 与膜结合的SecA 相互作用同某些生理活动是相关的,如GroEL 能与新合成的分泌蛋白或膜蛋白相互作用,促进蛋白质跨膜转运或促进其插入细胞质膜中。GroEL 作为分子伴侣参与蛋白质跨膜转运可能是通过维持SecA 在各种条件下的功能活性构象来实现的。,68,体外实验发现GroEL 几乎和任何非天然的模式蛋白作用,然而在体内,GroEL 仅参与约1/10 的新生肽的折叠过程。用免疫共沉淀及二维聚丙烯酰胺凝胶分
49、离GroEL的作用底物,Walid 等得到52 种GroEL 结合的蛋白质,包括转录-翻译机制中的组成成分,像RNA 聚合酶的亚基、延长因子Tu 和几个氨酰tRNA 合成酶,结果表明,GroEL 的典型底物的相对分子质量介于(2060)103 之间,其结构倾向于包括几个、结构域(同E.coli 内源蛋白比较),如S-腺苷甲硫氨酸合成酶包括3 个结构域,50S 核糖体蛋白L9、烯醇化酶、甘油醛232磷酸脱氢酶A 等均有2 个结构域。因为-螺旋和-折叠提供了同GroEL 顶端结构域作用的理想的疏水面,GroEL能很快识别含有结构的多肽,帮助其正确折叠。所以,我们可以用分子伴侣在大肠杆菌中的共表达来
50、提高新生肽的合成。,69,2.热休克蛋白70 家族 Hsp70 家族是进化史上最保守的蛋白质之一。它的家族成员包括四个:grp78、mtp70、hsc70及hsp70。前三种是在正常条件下产生的,而hsp70 是由应激诱导产生。Hsp70 同疏水的肽类有高亲和力,并且随着ATP 的水解而增高。Hsp70 与多肽之间的可逆作用在蛋白质的折叠、转运、错误折叠多肽的降解及其调控过程中有重要作用。Hsp70 之所以能起如此重要的作用是由它的结构决定的。,70,Hsp70 的结构,Hsp70 结构由两部分组成,一部分主要由一个N端高度保守的44kD的三磷酸腺苷酶(ATPase)功能域(ATP bindi
