蛋白质的生物合成张敏.ppt

《蛋白质的生物合成张敏.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质的生物合成张敏.ppt（148页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第四章：翻译及其调控,中心法则(The Central Dogma),转 录,翻 译,逆转录,DNA,RNA,蛋白质,复 制,第一节：蛋白质合成的生物体系,蛋白质的生物合成体系极其复杂：20种氨基酸,mRNA,核糖体,还包括多种蛋白质因子、其他蛋白质、酶类以及ATP、GTP等供能物质与必要的无机离子等：,（一）原核生物mRNA的特点,原核生物mRNA的起始密码AUG上游7个核苷酸以外有一段5-UAAGGAGG-3 的保守序列称为S-D(Shine-Dalgarno Sequence)。该序列是核糖体识别结合的位点,1、S-D(Shine-Dalgarno)序列,一.生物合成的模板mRNA,2、

2、多顺反子(polycistron),顺反子(cistron),遗传学将编码一个多肽的mRNA上的遗传单位称为顺反子,乳糖操纵子(lac operon)的结构,3、连续基因,多顺反子mRNA所转录的基因与基因之间有一段长度不等的间隔碱基序列，有的mRNA链上基因的间隔仅有1个碱基，甚至有编码序列相互重叠。,E和D：邻氨基苯甲酸合成酶的两个亚基A和B：色氨酸合成酶的、亚基C:吲哚甘油磷酸合成酶,前导序列,E,D,C,B,A,O,P,trpR,结构基因,（二）真核生物mRNA的特点,起始密码子常处于CCACCAUGG序列中，这段保守序列的存在能增加翻译起始的效率，这段序列称为Kozark序列(Mar

3、ilyn Kozark).,、Kozark序列(Marilyn Kozark),2、断裂基因,3、单顺反子,由于氨基酸有20种，而核苷酸只有4种，其对应关系不可能是 1核苷酸1氨基酸（414，420)2核苷酸1氨基酸（421620)但3核苷酸1氨基酸（436420）是可能的，这从理论上肯定了三联体密码子的结构形式。,Marshall Nirenberg(1961),遗传密码的破译,（三）、遗传密码,Nirenberg等设计的实验：用化学合成的mRNA为模板，利用无细胞体系进行体外翻译实验：,Poly(U)n多聚苯丙氨酸；UUU苯丙氨酸Poly(A)n多聚赖氨酸；AAA赖氨酸Poly(C)n多聚

4、脯氨酸；CCC脯氨酸Poly(G)n多聚甘氨酸；GGG甘氨酸Poly(AC)n苏氨酸/组氨酸交替组成的肽链 ACA苏氨酸？CAC组氨酸？Poly(AAC)n多聚苏氨酸；ACA苏氨酸,M.Nirenberg 1399),In vitro,tRNAaaRibosomeNitrocellulose filter,UCU(trinucleotides),阅读框架 指mRNA中从特定位点开始的，一段含有翻译密码的碱基序列。mRNA中的编码序列在被核糖体阅读和翻译时，从起始到终止都是以不重叠和不停顿的方式连续进行的，即从mRNA5端开始，以三个核苷酸为一组的方式进行。因此，就有可能存在三种阅读框架，每一种

5、框架只相差一个碱基的位移。三种框架的出现完全取决于哪一个核苷酸作为第一个密码子的第一个碱基。,一些基本概念：,开放阅读框架 指从AUG开始到终止密码子处的正确可读序列。通常情况下，在三种框架中，只有一种能够正确地编码有功能活性的蛋白质，而其它的阅读框架往往由于频繁出现终止密码子而被封闭。所以，一般一条mRNA序列仅编码一条蛋白质多肽链。,阅读框架可能存在的形式,核糖体选择正确的开放框架,封闭,遗传密码（genetic code）：是mRNA分子上按照53方向，每三个核苷酸与一种氨基酸对应，全部64种组合所形成的体系。密码子（codon）：每一个三联核苷酸的顺序称为密码子，也叫三联体密码。每一个

6、密码子与特定的一种氨基酸相对应。,终止密码（stop coden）：也称无意义密码子（nonsense coden）：没有对应的tRNA的反密码子与之结合，但能被蛋白质合成的终止因子或释放因子识别，终止肽链的合成。终止密码有3个：UAA、UAG、UGA起始密码（initiation/start coden）：AUG，是多肽链翻译开始的第一个密码子，在链内部则作为蛋氨酸的密码子。,1、方向性:mRNA分子中遗传密码阅读方向是从5端到3端。,2、连续性:mRNA分子中编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码是连续排列的，密码间无标点符号，没有间隔。移码突变,遗传密码的特点：,3、兼并性与偏爱性兼并性：

7、遗传密码的简并性通常是指密码子前两位碱基相同，第三位碱基不同仍编码相同的氨基酸。同义密码子：编码相同氨基酸的密码子统称为密码子家族，其成员互称为同义密码子。简并性现象决定了“同义突变”的存在，即DNA或mRNA序列中一个核苷酸的改变（点突变）可能并不影响其编码的多肽链中氨基酸的性质和序列。,偏爱性：是指虽然多数氨基酸有一个以上的密码子，但这些密码子的使用频率各不相同。原核生物和真核生物有着各自的密码偏爱性，如：脯氨酸的密码子有CCC（真核生物）和CCG（原核生物）；某一种密码子的使用频率与细胞内相应的tRNA的丰度一致，二者之间的相互协调有利于细胞内某一氨基酸含量高的蛋白质的顺畅表达。,理论意

8、义：遗传密码的偏爱性可以作为基因表达调控的一种机制，例如基因序列中出现稀有密码子时，可以使蛋白质的生物合成受到延迟。实践意义：当人们期望人工合成的基因片段能在细胞内高效表达时，应考虑采用该细胞偏爱的密码子作为基因的密码子，以此来指导人类对基因的改造。,4、摆动性 是指在蛋白质生物合成过程中，密码子的第三位碱基总是处于一个不稳定的位置，它与反密码子的第一个碱基配对结合的强度不如前两个碱基，即“摆动碱基配对”。其结果是使一种tRNA分子可与一个以上的密码子碱基配对。,U A U,摆动配对,密码子、反密码子配对的摆动现象,结果：一种tRNA能与多个一二位相同的三联体密码配对（简并密码子）,5、通用性

9、：遗传密码的通用性是指从最简单的生物一直到人类，除个别细胞器的特殊密码子外，遗传密码都是相同的。理论意义：这对进化过程中生物物种的稳定性及物种之间的相互联系与沟通是十分重要的。实践意义：这对现代基因工程，利用低等细胞生成包括人类在内的高等哺乳动物基因产物提供了可能性。,二、蛋白质生物合成的场所,场所：核糖体（ribosome),结构:Mg2+,蛋白质，rRNA,核糖体RNA的作用,1.大亚基rRNA具有肽酰基转移酶活性,催化肽键的合成。,2.小亚基具有mRNA上S-D互补的序列,是识别结合mRNA的位点。,3.核糖体大亚基5SrRNA具有两个保守序列,其中一个与tRNA的 TC环互补识别序列,

10、另一个与23SrRNA互补识别序列,稳定核糖体结构,容纳mRNA的部位;结合氨基酰tRNA的氨基酰位（amino-acyl site,位）；结合肽酰 tRNA 的肽酰位(peptidyl site,位）；,原核生物核糖体至少有6个功能部位:,tRNA 排出位(exit site,位）；肽基转移酶所在的部位；转位酶位点。真核生物核糖体结构与原核生物相似，但组分更复杂。,mRNA结合位点,核蛋白体与起始fmettRNAfmet的结合,tRNA种类：30种,同工tRNA：指携带不同的密码子，但识别 相同的氨基酸的一组tRNA。,三、蛋白质合成的搬运工具tRNA,tRNA的三级结构示意图,核糖体活性结

11、合位点,（1）氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase),2.氨基酸的活化,活化反应：,活化反应:形成酯键,.氨基酰-tRNA合成酶对底物氨基酸和tRNA都 有高度特异性。通过其活性部位实现的。.氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性，将错配 的进行校正。,氨基酰-tRNA合成酶的特点,（2）活化过程：,第一步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi,（3）活化氨基酸的表示方法：,氨基酰-tRNA的表示方法：Ala-tRNAAla Ser-tRNASerMet-tRNAMet,四、蛋白因子,（）起始因子：原核生物IF：IF，IF,IF 真核生物eIF：

12、eIF，eIF,eIF 帽结合蛋白（CBP/eIF)，eIF,（）延长因子EF：原核生物：EF-T，EF-G 真核生物：EF-EF-,（）释放因子 RF：原核生物：RF-1，RF-2,RF-3，真核生物：eRF-1，eRF-3,第二节：蛋白质合成过程,核糖体读码方向:53,肽链合成方向:N C,起始、延长、终止,一、起始：,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物。需起始因子（initiation factor,IF)参与,并消耗能量GTP(1个）,核蛋白体大小亚基分离；mRNA在小亚基上定位结合；起始fMet-tRNAiMet的结合；核蛋白体大亚基结合。,原核生

13、物合成起始,IF-1,1、核蛋白体大小亚基分离,目 录,IF-1，IF-3与小亚基结合促进大小亚基分离,2、mRNA在小亚基定位结合,IF-3促进mRNA在小亚基定位结合,（1）mRNA位于起始密码上游8-13核苷酸部位，存在4-9个核苷酸保守序UAAGGAGG（S-D，核糖体识别序列）（2）原核生物小亚基的3端存在与之互补序列 AUUCCUCC反向互补配对。,mRNA定位基础：,S-D序列,RNA-RNA识别 RNA-蛋白质识别,IF-1,3、起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAimet)结合到小亚基,目 录,反密码子识别P位密码子,使起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAimet)结合到

14、小亚基就位.此时A位上面结合有IF-1,IF-3,IF-1,目 录,反密码子识别P位密码子,使起始氨基酰tRNA(fMet-tRNAimet)结合到小亚基就位.,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4.核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,目 录,大亚基结合，水解GTP消耗能量,释放起始因子,IF-3,IF-1,目 录,（二）真核生物翻译起始复合物形成,4、核蛋白体大亚基结合。消耗GTP,释放各因子.,1、核蛋白体大小亚基分离；,2、起始氨基酰-tRNA与小亚基P位结合；,3、mRNA在核蛋白体小亚基准确就位；,真核生物翻译起始复合物形成过程,eIF-3、eIF-2B 与小亚基结

15、合并在eIF-6的参与下,ATP,ADP+Pi,eIF4F复合物（elF4E、elF4G、elF4A），elF4B，PABP,elF-2、GTP（eIF-3、eIF-4C）,Met-tRNAiMet,二、肽链合成延长,概 述肽链合成：指根据mRNA密码序列的指导，按次序添加氨基酸从N端向C端延，伸肽链到合成终止的过程。,肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步：,核蛋白体循环(ribosomal cycle)：,进位(entrance)成肽(peptide bondformation)转位(translocation,延长因子(elongation facto

16、r,EF）,延伸过程所需蛋白因子称为延长因子 原核生物：EF-T(EF-Tu,EF-Ts)EF-G 真核生物：eEF-1,eEF-2,肽链合成的延长因子,又称注册(registration),1、进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,目 录,延长因子EF-T催化进位（原核生物）,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,目 录,A位成肽,2、成肽,A位,N端,延长因子EF-G有转位酶(translocase)活性，可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。,原核生物EF-G转位酶活性，消耗1GTP；真核生物eEF-2与EF-G

17、同源,3、转位,fMet,fMet,目 录,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,真核生物延长过程,肽链合成的延长因子,三、肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,需相应的蛋白因子(释放因子)参与,释放因子(release factor,RF)种类:,原核生物释放因子：RF-1，RF-2 RF-3 真核生物释放因子：eRF-1 eRF-3,1.识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；

18、而RF-2可识别UAA、UGA。需能量GTP,RF-3 GTPase2.诱导转肽酶（肽酰基转移酶）改变为酯酶活性,使肽酰基转移到水分子上面，肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,RF,目 录,蛋白质合成过程中一条mRNA上附着多个核蛋白体形成多聚核蛋白体.,多聚核蛋白体：,电镜下的多聚核蛋白体现象,目 录,多聚核蛋白体产生,（一）、抗生素(antibiotics)是微生物产生的能够杀灭或抑制细菌的一类药物。,三、蛋白合成与药物,抗生素类,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,四环素族抑制氨基酰入位,目 录,与氨基酰-tRNA 3端结构相似,抗生素类,嘌呤霉素作用示意图,与氨基酰 tRNA相似核糖体

19、错认为A位是活化的氨基酸,（二）干扰素：真核细胞感染病毒后能分泌一类有抗病毒作用的蛋白质,干扰素的分类：,白细胞INF-成纤维细胞-INF-淋巴细胞-INF-,干扰素的作用机理（1）干扰素诱导的蛋白激酶,dsRNA(病毒),核酸内切酶,（2）间接活化核酸内切酶使mRNA 降解,白喉毒素,+,+,ADP糖基化修饰,（三）毒素1、白喉毒素,2、植物毒素,红豆碱、蓖麻蛋白可以与真核生物核糖体大亚基结合，抑制肽链的延长。,第二节蛋白质的折叠与修饰加工,（一）分子伴侣,分子伴侣是细胞一类保守蛋白质，能识别肽链的非天然构象，通过与疏水肽段结合和释放作用（消耗ATP),消除蛋白质不正确的叠折，促进各功能域和

20、整体蛋白质的正确折叠。,2023年10月5日8时32分,烟台大学药学院 School Pharmacy of Yantai University,分子伴侣帮助新生肽链的正确折叠,分子伴侣分类,核糖体结合性分子伴侣 如：触发因子（TF），新生链相关复合物（NAC）,非核糖体结合性分子伴侣 如：热休克蛋白70家族，热休克蛋白60家族（蛋白质二硫键异构酶、肽酰脯氨酸异构酶等）,1、常见hsp70家族,包括：hsp40（DnaJ），hsp70（DnaK），GrpE,2、hsp60家族 又称为伴侣蛋白包括GroEL和GroES(真核细胞同源物HSP60,HSP10)家族，作用为非自发折叠的蛋白质创造折叠

21、的微环境,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,hsp60,hsp60,hsp60,（二）蛋白二硫键异构酶,部位:内质网二硫键异构酶在内质网腔活性很高,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳主要在细胞内质网进行。,功能:在肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,目 录,(三）肽-脯氨酰顺反异构酶,天然蛋白质多肽链中肽酰-脯氨酸间肽键绝大部分是反式构型，仅6%为顺式构型。肽-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的转换。肽-脯氨酰顺反异构酶也是蛋白质三维空间构象形成的限速酶。,二、蛋白质的加工,从核糖体上释放出的新生多肽链首先必

22、须正确折叠成具有三级结构的空间构象，然后再经过一系列的成熟和加工修饰过程才能真正成为有生物活性的蛋白质,该过程称为翻译后加工加工过程（post-translation processing)。,1、肽链N端fMet或Met的切除 脱甲酰酶（deformylase）:除去N-端 fMet甲酰基，留下Met作为第一个氨基酸；氨肽酶去除Met。,2、特定氨基酸的共价修饰,主要包括：磷酸化、甲基化、乙酰化、羟基化、亲脂化修饰。比如:胶原蛋白中赖氨酸、脯氨酸残基的羟基化；甲状腺球蛋白的碘化；信号传递分子中的络氨酸、丝氨酸、苏氨 酸的磷酸化。组蛋白精氨酸的乙酰化等,二硫键形成异构酶 谷胱甘肽,3、二硫键形

23、成和正确配对：,二硫键异构酶,部位:内质网二硫键异构酶在内质网腔活性很高,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳主要在细胞内质网进行。,功能:在肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,谷胱甘肽 链内二硫键形成起着重要作用。,G-SH:还原性谷胱甘肽。G-S-S-G:氧化性谷胱甘肽。,G-SH,链内二硫键形成机制,NADPH+H+,鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰,促黑素,脂解释放激素,4、多蛋白的加工,信号肽的去除 如：蛋白质的跨膜 酶原的激活 如：胰岛素原的C肽,5、前体蛋白的加工,蛋白质内含子的去除 某些新生蛋白质含有部分间隔序列等待切

24、割，其意义类似于hnRNA中的内含子，此片段称为内蛋白子。内蛋白质切割下来的肽段称为游离内蛋白子。游离蛋白子可以对自身的基因起切割作用，造成该内含子基因的转位。,1、亚基聚合 具有四级结构的蛋白质由两条以上的肽链通过非共价聚合，形成寡聚体(oligomer)。蛋白质各个亚基相互聚合所需的信息仍储存在肽链的氨基酸序列之中。这种聚合过程往往有一定顺序，前一步骤常可促进后一步骤的进行。,（二）空间结构的修饰,2、辅基连接 是指结合蛋白，如糖蛋白、脂蛋白、色蛋白、金属蛋白及各种带S 基的酶类等，其非蛋白部分(辅基)合成后与蛋白部分的连接。,第三节 蛋白质的转运与定位,一、蛋白质的转运,定义：蛋白质合成

25、后经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的目标位点，称为蛋白质的分选和运输，又可称为蛋白质的靶向输送（protein targeting)。,真核蛋白质合成后的去向：,输送入细胞器的蛋白质，存在3种运输机制：核孔转运：核内 核内、外膜上的核孔 跨膜转运：内质网、线粒体、叶绿体或过氧化物酶体，存在于膜上的蛋白质转运发挥了关键作用；小泡转运：从ER或从一个细胞器到另一个细胞器转运 转运小泡“出芽”和“膜融合”,游离核糖体上合成的蛋白质 一般属于细胞质蛋白质，还有一部分经过分选后再运输到各自最终定位的地方，包括核蛋白以及掺入到其他细胞器(线粒体、过氧化物酶体、叶绿体）的蛋白;膜结合核糖体合成的蛋白

26、质 主要指膜蛋白、分泌型蛋白以及滞留在内膜系统（内质网、高尔基复合体、溶酶体和小泡等）的可溶性蛋白。由于蛋白质合成的位点不同，也决定了蛋白质的去向和转运方式不同。,不同合成位点蛋白质的去向,真核生物蛋白质运输方式：翻译时运转：信号肽引导经内质网膜的运输途径翻译后运转：导肽引导的通过线粒体、叶绿体、过氧化物酶体、乙醛酸体的膜运输途径,信号序列(signal sequence)所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列。,（一）信号肽假说,靶向运输蛋白的信号序列或成分,信号肽(signal peptide)：新生的分

27、泌蛋白N-端含有的1335个氨基酸残基长度的信号序列，能引导分泌蛋白在细胞内的转运。,Blobel 1999年 诺贝尔生理学或医学奖,特点：端常常有1个或几个带正电荷的 碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸等；中间为1015个残基构成的疏水核心区，主要含疏水中性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等；C端多以侧链较短的甘氨酸、丙氨酸结尾，紧接着是被信号肽酶(signal peptidase)裂解的位点。,signal S.的基本结构,13 Gly，Ala,rich Arg+,Lys+-rich Phe,Leu,Ile,信号肽的一级结构,10-15-螺旋,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,目 录,蛋白转运因子

28、,hsp70,2、导肽 导肽位于蛋白质前体的端，含20 80个氨基酸残基，导肽所引导的“前 体”蛋白通过细胞膜时，被12种多肽酶水解后转化为成熟蛋白质。线粒体,叶绿体，过氧化物体等细胞器的膜蛋白是由导肽牵引和定位的，是肽链先合成后再分选和运输的，,(1)碱性氨基酸含量丰富,分散于不带 电荷的氨基酸中(2)缺失带有负电的酸性氨基酸残基(4)羟基氨基酸的含量很高。(5)有形成两性-螺旋的能力,结构特征:,导肽靶向引导肽链进入线粒体,三、分子伴侣参与蛋白质的跨膜运输靶向输送,蛋白质跨膜时分子伴侣的作用是保持蛋白质处于未折叠的柔性结构。蛋白质跨膜后，另一种分子伴侣协助其形成正确的构象，如：HsP70首

29、先就与尚未折叠或部分折叠的蛋白质前体结 合，使前体分子不会发生凝集；在随后靶向线粒体的过程中，HsP70也始终参与和协助运 输。,(四)蛋白质的正向转运和逆向转运,真核细胞分泌蛋白前体合成后靶向输送过程：,细胞质核糖体粗面内质网形成输送小泡高尔基体形成分泌小泡泡吐到细胞外部,正向转运：在内质网-高尔基系统中，运载蛋白质的小泡不断的从内质网到高尔基体的运输过程。COP-逆向转运：某些蛋白质进入高尔基体后通过特殊的信号，从高尔基体返回内质网的小泡的运输过程。COP-逆向运输可以不负载任何货物。对保持内质网膜体系的稳定十分重要。,二、蛋白质的定位,（一）分泌型蛋白靶向运输分泌过程：内质网结合核糖体粗面内质网输送小泡高尔基体分泌小泡靶部位或泡吐到细胞外部,（二）线粒体蛋白质的定位,（三）细胞核蛋白质的定位,（四）溶酶体蛋白质的定位,