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1、第七章 食品中致病球菌的检验,第一节 金黄葡萄球菌及其检验,金黄色葡萄球菌及其检验,金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属,金黄色葡萄球菌是该属中的一个种.引起人类疾病的葡萄球菌主要是金黄色葡萄球菌,除可引起皮肤组织炎症外,还可产生肠毒素.如果该菌在食品中大量生长繁殖,产生毒素,人误食了含有毒素的食品,就会发生食物中毒,因此,由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒.食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在威胁,所以检验食品中的金黄葡萄球菌及数量具有实际意义.,主要内容,一、金黄色葡萄球菌的生物学特性二、金黄色葡萄球菌的检验,一、金黄色葡萄球菌的生物学特性,1、形态与染色2.分型简介3、培养特性4.
2、生化特性5.毒素与酶6.抵抗力7.致病性,1、形态与染色：(staphylococcus aureus),典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。,典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。,葡萄球菌革兰染色镜下图,金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片,金黄色葡萄球菌的透射电镜照片,2.分型简介,血清学分型：金黄色葡萄球菌水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原 蛋白抗原主要为葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一种表面抗原，90%以上金黄色葡萄球菌有此抗原，无特异性。多糖抗原为半抗原，有
3、型特异性。噬菌体分型根据肠毒素分型根据血浆凝固酶分型,3、培养特性,金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度 37C,最适生长pH 7.4。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。在肉汤培养基中生长迅速，37,培养后24h,呈均匀浑浊生长,延长培养时间,管底出现少量沉淀,轻轻振摇,沉淀物上升,旋即消散,培养2-3d后可形成很薄的菌环,在管底则形成多量粘稠沉淀。,3、培养特性,葡萄球菌在普通营养琼脂平板上培养24-48h后,可形成圆形凸起、边沿整齐、表面光滑、湿润、有光泽、不透明的菌落，直径1-2mm。可产生不同的色素。如金黄、柠
4、檬，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只限于培养物，而不外渗至培养基中。金黄色葡萄球菌在血平板上形成的菌落较大，多数致病菌株可产生溶血毒素，菌落周围形成透明的溶血圈(溶血圈)，非致病性球菌则无此现象。,金黄色葡萄球菌的平板菌落照片（普通培养基）,4.生化特性,葡萄球菌大多数菌株可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。致病菌株多，能分解甘露醇产酸。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素产氨，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。,金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落,金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于
5、其产生的毒素和侵袭性酶。产生的毒素和酶主要有下列几种：（1）溶血毒素：外毒素，可使动物红细胞溶解，培养时出现溶血环。按抗原性不同，至少有、五种，对人类致病作用的主要是溶血素。溶血素是一种外毒素，具有良好的抗原性。经甲醛处理可制成类毒素。,5.毒素与酶,5.毒素与酶,（2）杀白细胞素：使寄主白细胞崩解死亡，是一种毒性蛋白。（能杀死人和兔的多形核粒细胞和巨噬细胞。此毒素有抗原性，不耐热，产生的抗体能阻止葡萄球菌感染的复发。）,（3）肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C1、C2、D、E及F六种血清型。该毒素为一种可溶性蛋白质，耐热，10030分钟不破坏。肠毒
6、素可引起急性胃肠炎即食物中毒，以A型引起的食物中毒最多。,5.毒素与酶,5.毒素与酶,（4）血浆凝固酶：血液凝固的本质是血浆内的可溶性纤维蛋白原转变为不溶解的纤维蛋白.正常人体在钙离子的参与下凝血酶原转变为凝血酶.在血液中加入枸橼酸钠,可与血浆中的钙离子结合成不解离的枸橼酸钙,凝血酶不能形成,血凝的化学反应不能进行.血浆凝固酶是能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质，致病菌株多能产生，如金黄葡萄球菌。常作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志。当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。同时，凝固酶集聚在菌体四周，亦能保
7、护病菌不受血清中杀菌物质的作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关。,（5）溶纤维蛋白酶 可使人及家兔、犬的已凝固的纤维蛋白溶解。溶纤维蛋白酶是一种激酶，可激活血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶而使纤维蛋白溶解。初次培养后，菌落周围若出现一个不透明圈，表示产生凝固酶；继续培养时，不透明圈消失，说明是溶纤维蛋白酶作用的结果。（6）透明质酸酶 透明质酸酶具有高度的粘稠性，是机体结缔组织中基质的主要成分。它被透明质酸酶水解后，结缔组织细胞间失去粘性呈疏松状态，有利于细菌和毒素在机体内扩散，因此透明质酸酶又称为扩散因子。,5.毒素与酶,（7）脱氧核糖核酸酶 金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用
8、来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；（8）其它 葡萄球菌还可以产生表皮溶解毒素、蛋白酶、磷酸酶、卵磷脂酶、脂酶、肽酶等，使细菌具有侵袭力。,5.毒素与酶,6.抵抗力,金黄色葡萄球菌对热和干燥的抵抗力较一般无芽胞细菌强，加热8030分钟才被杀死。在干燥的脓汁、痰液中可存活2-3月。5%石炭酸中10-15分钟死亡。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。对青霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感，但易产生耐药性。,7.葡萄球菌的致病性,（1）引起的主要疾病 化脓性感染：如毛囊炎、疖、痈、伤口化脓、气管炎、肺炎、中耳炎、脑膜炎、心包炎等；全身感染：如败血症、脓毒血症等 食物中毒,金黄色葡萄球菌引起的下
9、颚感染,金黄色葡萄球菌引起的须疮感染,7.葡萄球菌的致病性,（2）生存场所 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。,7.葡萄球菌的致病性,（3）流行病学特点 a.发病率高 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。b.季节分布 多见于春夏季。,7.葡萄球菌的致病性,（3）流行病学特点 C.中毒食品种类多 如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中
10、毒事件也有报道。d.污染食品途径：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。,7.葡萄球菌的致病性,（3）流行病学特点 e.肠毒素引起的中毒多 金黄色葡萄球菌肠毒是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。,7.葡萄球菌的致病性,（3）流行病学
11、特点 e.肠毒素引起的中毒多 肠毒素形成条件：存放温度，在37C内，温度越高，产毒时间越短；存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,二、金黄色葡萄球菌的检验方法：增菌培养法、直接计算法,(一)检验原理:金黄葡萄球菌耐盐性强，在100-150g/L氯化钠培养基中能生长，适宜生长的盐浓度为5-7.5%，可以利用这个特性对金黄葡萄球菌增菌，抑制杂菌。金黄葡萄球菌可产生溶血素，在血平板上生长，菌落周围有透明的溶血环；可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱，所以在baird-parker(含卵黄和亚碲酸钾)平板上生长，
12、菌落为黑色，周围有一浑浊带,在其外层有一透明圈，利用此特性可分离金黄葡萄球菌；金黄葡萄球还可产生凝固酶，酶可使血浆中的可溶性纤维蛋白原变成不溶解的纤维蛋白，使血浆凝固，这是鉴定致病性金黄葡萄球菌的重要指标，是否是致病的金黄葡萄球菌主要看它是否产生凝固酶。,二、金黄色葡萄球菌的检验,增菌培养法(二)检验程序金黄色葡萄球菌检验程序如图 检样稀释7.5%NaCl 肉汤增菌培养 血平板、BP分离镜检、血浆凝固E试验报告结果,二、金黄色葡萄球菌的检验,(三)操作步骤1、检样处理 称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。2、增菌 吸取5mL
13、上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨豆肉汤50mL培养基内，置361温箱培养24h。在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长,二、金黄色葡萄球菌的检验,3、平板分离血平板：菌落成金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有透明溶血圈（型）,二、金黄色葡萄球菌的检验,BP平板：主要成分及作用：氯化锂、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生长丙酮酸钠:促进葡萄球菌生长亚碲酸钾:抑制G-杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色卵黄:含蛋白质、卵磷、脂肪,二、金黄色葡萄球菌的检验,BairdParker平板，361培养24h。圆形、光滑凸起、湿润、直径为2-3mm
14、，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。,金黄葡萄球菌在BairdParker平板上的菌落形态,二、金黄色葡萄球菌的检验,4、镜检及血浆凝固酶试验 挑取金黄色葡萄球菌可疑菌落进行革兰氏染色。为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5-1m。,二、金黄色葡萄球菌的检验,如发现葡萄球菌,再做血浆凝固E试验 吸取14新鲜兔血浆0.5mL，放入于8mm100mm试管内，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现
15、凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。,金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验,二、金黄色葡萄球菌的检验,直接计数方法 吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块BairdParker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在361温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。,四、金黄色葡萄球菌的检验,在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36124h培养后进行染色镜
16、检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。,二、金黄色葡萄球菌的检验,结果报告（1）初步报告：根据血平板培养计数和镜检，如发现有G+葡萄串状球菌存在，且有溶血性，则初步报告为：“有金黄色葡萄球菌存在，1g样品约含多少。”（2）结果报告：根据培养特性、镜检、生化试验、动物试验结果，可报告为：“是否是致病性葡萄球菌”。血浆凝固试验阳性,在血平板上菌落周围有透明的溶血环,形态符合金黄葡萄球菌特点的菌株被鉴定为金黄葡萄球菌.,思考题,1、金黄色葡萄球菌可产生哪些毒素和酶？2、金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落特征如何，说明其原理。3、金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征如何，说明其原理。4、确认葡萄球菌为金黄色葡萄球菌的依据至少应包括哪几个试验？5、金黄色葡萄球菌的形态与染色、培养特征如何？,
