食品微生物第十二章常见致病g.ppt

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1、第十二章 常见革兰氏阳性致病菌,基本内容:葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）、单核细胞增生李斯特氏菌和蜡样芽孢杆菌的基本生物学特性，来源、分布及传播途径，导致的常见疾病（症状和致病机理），常用检测方法，预防和控制方法。,重点和难点:金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和蜡样芽孢杆菌的生物学特性，常见病症状和致病机理，检测方法。,第一节 葡萄球菌和金黄色葡萄球菌病,一、概述,1880年，巴斯德首次从一患者瘀肿的脓汁中发现葡萄状排列的细菌，将其注射给家兔后可致脓疮；,1883年，Becker获得了纯培养，证实该菌为葡萄球菌属；,1881年，Ogsten确证化脓过程是“某”菌所致；,一、概述,葡萄球菌（S

2、taphylococcus)因堆聚成葡萄串状而得名，为最常见的化脓性球菌；,葡萄球菌属在分类地位上属于微球菌科的一个属（目前有32种，寄生人体的有16种），大部分为非致病菌，少数可导致疾病。葡萄球菌是医院交叉感染的重要来源。,金黄色葡萄球菌（S.aureus),表皮葡萄球菌（S.epedermidis),腐生葡萄球菌（S.saprophyticus),金黄色葡萄球菌为最常见致病菌,一、概述,美国CDC报道：美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大为45%；我国和其它国家也有类似的情况。,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)在自然界中无

3、处不在，空气、土壤、水、饲料、食品、灰尘及人和动物的排泄物中均可找到；,一、概述,二、葡萄球菌的基本特性,2.1 形态结构 葡萄球菌呈球形或稍呈椭圆形，直径0.41.2m，分裂后许多菌体无规则的堆积在一起，成葡萄串状。,葡萄球菌无鞭毛，不能运动。无芽胞，除少数菌株外一般不形成荚膜。易被常用的碱性染料着色，革兰氏染色为阳性。,二、葡萄球菌的基本特性(2.1 形态结构）,其衰老、死亡或被白细胞吞噬后，以及耐药的某些菌株可被染成革兰氏阴性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.2 培养特征,营养要求不高，普通琼脂培养基上生长良好，形成圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明的菌落。,在含有血液和葡萄糖的培

4、养基中生长更佳。在肉汤培养基中24h后呈均匀混浊生长。需氧或兼性厌氧，少数专性厌氧。,不同种的菌株产生不同的色素，色素为脂溶性，如金黄色、白色、柠檬色。血琼脂平板上形成的菌落较大，有的菌株菌落周围形成明显的全透明溶血环（溶血），也有不发生溶血者。凡溶血性菌株大多具有致病性。,二、葡萄球菌的基本特性（2.2 培养特征）,金黄色葡萄球菌（溶血）,表皮葡萄球菌,28-38均能生长，致病菌最适温度为37，pH为4.5-9.8，最适为7.4；,二、葡萄球菌的基本特性（2.2 培养特征）,在含有2030%CO2的环境中培养，可产生大量毒素。,耐盐性强，在含有1015%的NaCl培养基中能生长；,二、葡萄球

5、菌的基本特性,2.3 生理生化特性,各种葡萄球菌的主要生理生化特性,各种葡萄球菌的主要生理生化性状（续表）,二、葡萄球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,二、葡萄球菌的基本特性（2.3 生理生化特性）,注：“”为阳性，“”为阴性。,各种葡萄球菌的主要生理生化性状（续表）,二、葡萄球菌的基本特性,2.4 抗原结构,葡萄球菌抗原结构复杂，已发现的有30种以上，对其活性及组成比较了解的有以下几种：,2.4.1 葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein A，SPA)SPA是存在于90%以上的金黄色葡萄球菌细胞壁表面的一种蛋白质，是一种单链多肽，与细胞壁肽聚糖共价连接，但有1/3分

6、泌于胞外。,SPA为完全抗原，具有特异性，它可与人IgG1、IgG2和IgG4的Fc段发生非特异性结合。具有与吞噬细胞竞争Fc段复合物、促细胞分裂、引起超敏反应、损伤血小板等多种生物活性。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原结构）,所有来自人类的菌株均有此抗原，动物源株则少见。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4 抗原结构）,2.4.2 多糖抗原 多糖抗原为半抗原，有两种，具群特异性，可用以分群。A群多糖抗原多存在于金黄色葡萄球菌，其化学组成为N-乙酰葡萄糖胺核糖醇磷壁酸（多糖A）。B群多糖抗原多存在于表皮葡萄球菌，化学组成是N-乙酰葡萄糖甘油型磷壁酸（多糖B）。,二、葡萄球菌的基本特性（2.4

7、 抗原结构）,2.4.3 荚膜抗原 主要为金黄色葡萄球菌菌株的表面抗原。,几乎所有金黄色葡萄球菌菌株表面都有荚膜抗原的存在，个别表皮葡萄球菌菌株有此抗原。,二、葡萄球菌的基本特性,2.5 抵抗力,葡萄球菌抵抗力较强，为不形成芽孢的细菌中最强者。在干燥的脓汁或血液中可存活数月；80加热30 min才能将其杀死，煮沸可迅速使其死亡；在5%石炭酸或0.1%汞中1015min死亡。对某些染料较敏感，1100 0001200 000稀释的龙胆紫溶液能抑制其生长；对磺胺类药物的敏感较低，对青霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感。,葡萄球菌肠毒素是一种外毒素，具耐热性，经100加热30min而不被破坏，要使其完全

8、破坏需煮沸2h（葡萄球菌肠毒素的特点）；,二、葡萄球菌的基本特性（2.5 抵抗力）,其他如溶血素、杀白血球素等经100加热10min或80加热20min就可丧失毒性。,二、葡萄球菌的基本特性,2.6 金黄色葡萄球菌噬菌体型 依据：绝大多数金黄色葡萄球菌可被相应的噬菌体裂解。,根据噬菌体对金黄色葡萄球菌菌株的裂解反应，可将金黄色葡萄球菌分为5群26型（见下表）：,二、葡萄球菌的基本特性（2.6 金黄色葡萄球菌噬菌体分型）,金黄色葡萄球菌噬菌体分型,二、葡萄球菌的基本特性（2.6 金黄色葡萄球菌噬菌体分型）,肠毒素型食物中毒主要是由、群的金黄色葡萄球菌引起；造成医院感染严重流行的多为群中的52、5

9、2A、80型引起。,噬菌体分型在金黄色葡萄球菌流行病学调查、追踪传染源及研究菌型与疾病的关系等方面均有重要意义。,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途径,3.1 分布 流行呈季节性分布，多见于夏、秋两季。引起中毒食品种类：奶、肉、蛋、鱼及其制品等动物性产品；此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕、凉粉等也经常被其污染而导致中毒。,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途径,3.2 污染途径,不同人群或动物金黄色葡萄球菌带菌率,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途径,途径二：食品二次污染,熟肉类食品如在熟后污染了致病性葡萄球菌，又在2030的环境下放置较长时间，极易引起中毒；奶和奶制品，用奶制作的冷饮（冰激凌、冰棍）和奶油

10、糕点常是引起中毒的食品；,三、致病性葡萄球菌的分布及污染途径（3.2 污染途径）,油煎鸡蛋、熏鱼、油浸鱼罐头等含油脂较多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能产生毒素。,四、金黄色葡萄球菌的致病性,4.1 致病类型及症状,有侵袭性疾病和毒素性疾病两种类型。4.1.1 侵袭性疾病症状：主要引起化脓性感染。金黄色葡萄球菌可通过多种途径侵入肌体，引起局部组织、内脏器官或全身性化脓感染。,局部感染主要表现为：甲沟炎、麦粒肿、蜂窝织炎、伤口化脓等；,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.1 致病类型及症状）,甲沟炎,麦粒肿,蜂窝织炎,内脏器官感染如：肺炎、脓胸、中耳炎、脑膜炎、心包炎、心内膜炎等；全身感染如：

11、败血症、脓毒血症等。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.1 致病类型及症状）,心包炎,心内膜炎,4.1.2 毒素性疾病,主要由金黄色葡萄球菌毒素所致。毒素性疾病有两种：,A.食物中毒：人摄入含毒素污染的食物后16h即可出现头晕、恶心、腹泻、呕吐等急性胃肠炎症状。发病12d可自行恢复，愈后良好。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.1 致病类型及症状）,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.1 致病类型及症状）,B.毒性休克综合症 由毒性休克综合症毒素1（TSST-1）引起。主要表现：高热、低血压、呕吐、腹泻、猩红样皮疹、严重者出现休克。注意：TSST-1并非是引起该综合症的唯一病因，细菌内毒素、葡萄球菌肠

12、毒素也与毒性休克综合症发病有关。,四、金黄色葡萄球菌的致病性,4.2 致病因子及相应致病机理,金黄色葡萄球菌的致病性取决于其产生的毒素的致病能力。,4.2.1 血浆凝固酶（Coagulase)是一种能使含有柠檬酸钠或肝素抗凝剂的兔或人血浆发生凝固的酶。大多数致病性葡萄球菌可产生此酶，非致病菌则不产生。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,血浆凝固酶有2种：,A：游离凝固酶（free coagulase)分泌至胞外，被血浆中凝固酶反应因子激活，形成葡萄球菌凝血酶（staphylothrombin)，能使纤维蛋白原变为纤维蛋白，导致血浆凝固。纤维蛋白沉积于菌体表面，阻碍体

13、内吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后，也不易被杀死。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,凝固酶集聚在菌体四周，可能保护病菌不受血清中杀菌物质的作用。,B：结合凝固酶（bound coagulase)也叫凝聚因子（clumping factor)，在菌体表面并不释放，为纤维蛋白原特异性受体，能与人或兔血浆中纤维蛋白原交联而引起细菌凝聚。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要标志。,凝固酶较耐热，100加热30min或高压灭菌后仍保存部分活性，但易被蛋白分解酶破坏。,凝固酶具有免疫原性，刺激机体产生的抗体对凝固酶阳

14、性的细菌感染有一定的保护作用。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,凝固酶具抗原性，可用于金黄色葡萄球菌的分型研究及流行病学研究。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,4.2.2 溶细胞毒素 该毒素为膜损伤毒素，主要有葡萄球菌溶素（staphylolysin)和杀白细胞素（leukocidin)。,A：葡萄球菌溶素 外毒素，多数致病菌株能产生，可使动物红细胞溶解，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,根据其对动物细胞的溶血范围、抗原性、溶血时所需温度不同等可将金黄

15、色葡萄球菌产生的葡萄球菌溶素分为、五种。五种溶素都是蛋白质，具抗原性。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,对人体有致病作用的主要是溶素和溶素。,溶素：由质粒或染色体编码，分子量为30kD，不耐热，60加热3min即可被破坏。除对多种哺乳动物红细胞有溶血作用外，对白细胞、血小板、肝细胞、成纤维细胞膜、血管平滑肌等均有毒性作用，可引起组织坏死。作用机理：毒素分子插入细胞膜疏水区，从而破坏膜完整性造成细胞溶解。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,溶素：为神经鞘磷脂酶C（sphingomyelinase C)，能水解细胞膜磷脂，损伤红细胞、白细胞

16、、巨噬细胞和纤维细胞，与组织坏死和脓肿形成有关。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,B：杀白细胞素 又称为Panton-Valentine(PV)杀白细胞素，由大多数致病性葡萄球菌产生，不耐热，有F和S两个组分。细胞膜上，S组分的受体主要是神经节苷脂GM1；F组分受体则为卵磷脂。,致病原理：杀白细胞素与受体结合，改变细胞膜的结构，使细胞对阳离子（K离子）的通透性增加，引起人和动物中性粒细胞和巨噬细胞的损伤，最终导致细胞死亡。死亡细胞可形成脓栓，加重组织感染；大量吞噬细胞的损伤可影响肌体的免疫防御能力。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,四

17、、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,4.2.3 葡萄球菌肠毒素(staphylococcus enterotoxin,SE),葡萄球菌肠毒素：为血浆凝固酶或耐热核酸酶阳性菌株产生的一类结构相似、毒力相似、抗原不同的胞外蛋白质。,金黄色葡萄球菌是引起食品污染的常见细菌，被其污染的食品中，在2037C下经48h即可产生大量的毒素。约有3050%的菌株可以产生肠毒素。,基本特性：蛋白质，分子量为26KD30KD，热稳定，10030min不被破坏，不受胰蛋白酶影响，能抵抗胃液中蛋白酶的水解作用。,资料报道，在每100g食物中含有不足18g的葡萄球菌肠毒素便能引起金黄色葡萄球菌食

18、物中毒症状。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,迄今从血清型上已被鉴定的SE有11种，分别为：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K型，其中C型又根据等电点的不同分为3个亚型（C1、C2、C3）。各型肠毒素均可引起食物中毒，其中以A型引起的食物中毒最多，B型和C型次之，F型肠毒素是引起毒性休克症的毒素。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,致病机理：葡萄球菌肠毒素是一种超抗原，和普通抗原相比，可激活更多的T细胞，释放过量的细胞因子（如INF，IL-1，IFN-）而致病。另外，

19、该毒素在肠道作用于内脂神经受体，传入中枢，刺激呕吐中枢，引起呕吐，并产生急性胃肠炎症状。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,葡萄球菌肠毒素导致的急性肠胃炎病一般潜伏期为16小时，最短者0.5小时即发病，出现头晕、呕吐、腹泻等症状，发病12日可自行恢复，预后良好。,1-6小时,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,4.2.4 剥脱毒素（exfoliatin),该毒素由蛋白质组成。,致病机理：具丝氨酸蛋白酶功能，可裂解细胞间桥小体，破坏细胞间的连接，引起葡萄球菌烫伤样皮肤综合症（staphylococcal scalded skin syndro

20、me,SSSS)。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,4.2.5 毒性休克综合症毒素1（toxin shock syndrome toxin-1,TSST-1),该毒素也称致热外毒素C和肠毒素F，是某些金黄色葡萄球菌在生长过程中分泌的一种外毒素。该毒性蛋白由细菌染色体编码，含有194个氨基酸，分子量为2.049KD。毒素结构类似于葡萄球菌肠毒素B，引起发热、休克及脱屑性皮疹，称为毒性休克综合症（toxic shock syndrome，TSS）。,致病机理：抑制内毒素脱毒或直接损伤肝脏细胞，使内毒素在体内

21、蓄积；刺激单核吞噬细胞系统释放血管活性物质，干扰心血管系统及血液动力学；增加毛细血管通透性，造成心血管功能损伤而导致休克。,四、金黄色葡萄球菌的致病性（4.2 致病因子及相应致病机理）,五、金黄色葡萄球菌的检测,5.1 常用检测方法：GB/T4789.102008,流程：,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.1 常用检测方法）,S.aureus on Baird-Parker Agar,五、金黄色葡萄球菌的检测,5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法,5.2.1 金黄色葡萄球菌鉴别培养基,Baird-Parker-f-RPF培养基 由法国生物梅里埃公司研制，该培养基是在BP琼脂的基础上加入RPF（兔血浆

22、纤维蛋白原）。,该培养基营养丰富，以氯化锂代替亚碲酸钾，血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌，将在培养基中呈现有晕环的黑色菌落。,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法）,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法）,5.2.2 3M金黄色葡萄球菌快速测试法,原理：Petrifilm.RSA Count Plate由美国3M公司研制生产，是一种薄膜型快速检测金黄色葡萄球菌的记数平板。,3M Petrifilm Staph aureus Count,测试薄膜是由二部分组成。第一部分是黄金色葡萄球菌培养基片。此培养基中含有经修正的Barid-Parker营养成分及

23、冷水可溶解的胶质。第二部分是一种耐热核酸酶（TNase）反应片。含有DNA、甲苯胺蓝(ToluidineBlue-O)及四唑指示剂(Tetraeolium)，此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法）,耐热脱氧核糖核酸酶为产毒金黄色葡萄球菌的典型特征酶，是鉴定金黄色葡萄球菌的标志酶之一。在Petrifilm.RSA检测片上，耐热DNA酶反应呈粉红色环带，包围着一个红色或蓝色的菌落。,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法）,五、金黄色葡萄球菌的检测,5.3 金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法,5.3

24、.1 动物学试验法,五、金黄色葡萄球菌的检测（5.2 金黄色葡萄球菌快速检测方法）,5.3.2 血清学试验法 金黄色葡萄球菌肠毒素为胞外蛋白，为超抗原，可用ELISA法进行检测。,5.3.3 分子生物学方法 如：核酸分子杂交法和PCR法。可用来检测编码肠毒素的特异性基因（entA、entB、entC、entD、entE等）。,六、金黄色葡萄球菌的预防与控制措施,6.1 防止金黄色葡萄球菌污染食品（1）防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。,（2）防止

25、金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。,六、金黄色葡萄球菌的预防与控制措施（6.1 防止金黄色葡萄球菌污染食品）,（3）防止金黄色葡萄球菌对肉及其制品的污染：对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。,6.2 防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成 应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。,六、金黄色葡萄

26、球菌的预防与控制措施,第二节 单核细胞增生李斯特氏菌及其食物中毒,一、概论 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria.monocytohenes）是一种能在冷藏温度存活的致病菌。其细胞的苯酚-水浸出物可以诱导单核细胞的生成。,一、概论,1891年和1911年：有文献记载和描述过该细菌；1926年：Murray等首次在患病兔和豚鼠肝脏中分离到单核细胞增生李斯特氏菌；1929年：最先记录人类感染单核细胞增生李斯特氏菌，之后它被确诊为引起孕妇产期感染脑膜炎的元凶。,1999年底，美国发生了历史上因食用带有李斯特菌的食品而引发的最严重的食物中毒事件。据美国CDC资料显示，在美国密歇根州有14人因食用被

27、该菌污染的“热狗”和熟肉而死亡，在另外22个州97人患此病，6名妇女流产。,一、概论,2001年11月以来，我国质检部门多次在从美国、加拿大、法国、爱尔兰、比利时、丹麦等二十多家肉类加工厂进口的猪腰、猪肚、猪耳、小排等三十多批近千吨猪副产品中检出单增李斯特菌、沙门氏菌等致病菌。,一、概论,一、概论,李斯特氏菌属有七个菌种：（1）单核细胞增生李斯特菌(L.monocytohenes)（2）绵羊李斯特菌(L.ivanovii)（3）英诺克李斯特菌(L.innocua)（4）威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)（5）西尔李斯特菌(L.seeliger)（6）格氏李斯特菌(L.grayi)（7）

28、默氏李斯特菌(L.murrayi),二、生物学特性,2.1形态特征,G+，类球形杆菌，大小为（0.40.5）um（0.52.0）um，直或弯曲，两端钝圆，单个、呈V字型排列或成队排列，兼性厌氧，无芽孢，一般不形成荚膜（营养丰富环境可形成），陈旧培养物中菌体可呈丝状、革兰氏染色阴性，有4根周毛和1根鞭毛，周毛易脱落。,二、生物学特性,2.2 培养特征,通常在大多数细菌培养基上生长良好。,（1）胰蛋白胨琼脂 单核细胞增生李斯特菌最佳培养保存用培养基。形成圆形、光滑、稍扁平的透明菌落。,二、生物学特性(2.2 培养特征),(2)在含2.5g/L琼脂、80g/L明胶和10g/L葡萄糖的半固体培养基中:

29、37培养24h，生长物沿穿刺线以不规则云雾状延伸到培养基内，进而扩散到整个培养基。生长达最高量时在培养基表面下35mm处形成一似伞状界面。,二、生物学特性(2.2 培养特征),(3)羊肝浸出液琼脂 透射光观察为圆形、光滑、奶油状、稍扁平菌落；反射光观察为乳白色菌落。菌落有光滑型、中间型和粗糙型三种。,（4）血琼脂平板 菌落周围有溶血带或溶血圈。少数菌株强烈溶血，其余菌株溶血较弱。,A,B,C,二、生物学特性(2.2 培养特征),该菌生长需要B族维生素（生长素、核黄素、硫胺素和硫辛酸）和氨基酸（半胱氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸等）。适宜在中性或偏碱性的介质中生长，pH范围为5.29.6，在低

30、于5.2条件下仍可存活数周到数月。抗盐能力强，在04条件下，该菌在25.5%NaCl水溶液中可存活数月。,二、生物学特性(2.2 培养特征),单核细胞增生李斯特菌是嗜冷菌，在0 50及冰箱温度下均能生长。最适生长温度为37。,Growth and Survival of Listeria at Low Temperatures,二、生物学特性,2.3 生化特性,李斯特氏菌属不同种间生化特性,二、生物学特性（2.3 生化特性）,李斯特氏菌属不同种间生化特性（续表）,注：+，90%菌株呈阳性反应；，90%菌株呈阴性反应；d，1189%菌株呈阳性反应。,二、生物学特性,2.4 血清型分类,单核细胞增

31、生李斯特氏菌具有菌体抗原（O）和鞭毛抗原（H），有13个血清型，见下表（含其他李斯特菌）：,李斯特氏菌属不同菌种间血清型分布,二、生物学特性（2.4 血清型分类）,单增李斯特菌13个血清型中，其中：3种（1/2a、1/2b和4b）占临床感染的90%；最常见的为1/2b；通常引起食源性感染的是4b。1966年以来，有记载爆发的24起单核细胞增生李斯特氏菌疾病中14起属于4b，占58%；8起属于1/2a，占11%。,二、生物学特性,2.5 抵抗力,对理化因素抵抗力较强：在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活；,对碱和盐抵抗力强：25g/L NaOH中经20min才杀死，在200g/L NaCl中

32、4可存活8周；,6070加热520min可杀死；70%酒精、25g/L 石炭酸、25g/L 福尔马林20min可杀死；对氯霉素、青霉素、氨苄青霉素、四环素、红霉素、新霉素和磺胺药物敏感，抗多粘菌素。,二、生物学特性（2.5 抵抗力）,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现,在自然界广泛分布，能耐受较高的渗透压。易从健康的人和动物体、腐烂的果品蔬菜、土壤、动物产品、粪便、青储饲料、水及水产品等载体中分离。,3.1 分布,不同载体中单核细胞增生李斯特氏菌的含菌量或检出率,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现（3.1 分布）,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现（3.1

33、分布）,不同载体中单核细胞增生李斯特氏菌的含菌量或检出率（续表）,3.2单核细胞增生李斯特氏菌污染食品造成的感染,带菌食品类型：软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰淇淋、生牛排、羊排、卷心菜沙拉、芹菜、番茄、法式馅饼和冻猪舌等。,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现（3.1 分布）,途径一：通过粪口途径进行传播（主要途径）；,传播途径：,途径二：该菌还可通过眼睛及损伤皮肤、黏膜进入人体内而造成感染；孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿；性接触也是本病传播的可能途径，且呈上升趋势。,传播途径及感染类型：,

34、三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现（3.2 传播和感染）,3.3 流行病学 人类感染单核细胞增生李斯特氏菌发病率为：215人/100 0000人，死亡率约为30%左右；通常免疫力低下、老人和感染菌血症的婴儿死亡率较高，有报道可高达75%。,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现,单核细胞增生李斯特氏菌引起的部分食源性疾病爆发,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现（3.3 流行病学）,三、单核细胞增生李斯特氏菌的流行病学与临床表现,3.4 临床症状,典型症状一:个体免疫机能受损引起的感染，如：似流感样症（畏寒、发热、头痛和血尿等），死亡率较高，甚至达30%；流产；死

35、胎；脓血症；脑膜炎,症状二：温和性胃肠炎症状,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理,4.1 细菌的毒力岛 单核细胞增生李斯特氏菌毒力岛：又称致病岛，是指编码该菌毒力基因簇的相对分子量比较大的染色体DNA片段。特点：两侧一般具有重复序列和插入元件，通常位于细菌染色体tRNA基因位点内或附近，不稳定，含有潜在的可移动元件。基因产物：分泌性蛋白或细菌表面蛋白。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,编码LM相关致病性的毒力基因有两簇，称单核细胞增生李斯特氏菌毒力岛LIPI-1和单核细胞增生李斯特氏菌毒力岛LIPI-2。4.1.1 毒力岛LIPI-1及相关基因

36、功能 位于9kb大小的染色体上，其两侧分别为prs和ldh位点，有6个基因，从prs下游开始，依次为prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB。,mpl-actA-plcB：位于hly下游。Mpl基因产物mpl蛋白加工酶，为锌依赖蛋白酶，能起到外毒素作用；actA基因编码表面蛋白ActA，与细菌肌动蛋白聚合性运动有关，也与细菌被宿主细胞内化有关。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,3种基因产物可使李斯特菌在宿主细胞与细胞之间互相传递，可有效避免宿主免疫系统体液效应蛋白损伤。,plcB基因编码磷酸酯酶C，能水解宿主细胞上大多数的磷脂。,四、单核细胞

37、增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,Hly基因：编码Hly蛋白，大小60kD，称为单核细胞增生李斯特氏菌溶解素（listeriolysin O),是一种孔形成毒素（pore-forming-toxin），能破坏吞噬体，促使菌体进入胞液，是细菌在胞液内增殖的先决条件，是主要的毒力因子，其缺失将使细菌毒力因子全部丧失。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,plcA-prfA基因：位于hly基因上游，plcA编码plcA磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C；prfA编码prfA蛋白，是李斯特菌所有基因簇包括prfA本身转录激活所必须，是李斯特菌唯一的毒力

38、因子调节蛋白。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,4.1.2 毒力岛LIPI-2及相关基因功能,LIPI-2又称内化素小岛（internalin islets)，它是一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质家族。LM的内化素分两个型：其一为相对分子量大的蛋白质组成，通过其C-末端区黏附于细菌细胞壁上。此亚族代表是inlAB编码的InlA和InlB多肽。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,另一亚族由相对分子量较小的蛋白质组成，他们缺乏C-末端细胞壁锚定区而释放于胞外环境。LIPI-2在LM侵入宿主细胞的过程中起关键性作用，但目前仍不清

39、楚其对LM致病的确切机理。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理(4.1细菌的毒力岛）,4.2 低温生长和耐酸特性,LM在食源性疾病传播中的显著特点之一是可在低温条件下生长繁殖。分子生物学研究表明：该菌能表达四种不同的应激蛋白，即HrcA、sigmaB、Clp家族和所谓的第四类基因编码的三个冷休克蛋白。近年来细菌的抗酸基因gad也被发现，其表达的蛋白能分解胆盐，从而有利于细菌在哺乳动物肠道存活。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理,4.3黏附与侵袭 LM能黏附和进入哺乳动物细胞。LM通过表面的D-半乳糖残基与宿主细胞的D-半乳糖受体接合，可使细菌吸附在消化道的上皮细胞上。

40、其侵入可能是从肠道黏膜到达下层组织。,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理,4.4 破坏宿主免疫,LM在宿主体内感染途径：,口（食物）,胃肠道感染,侵入上皮细胞后被单核巨噬细胞吞噬,随巨噬细胞扩散到局部淋巴结,到达内脏器官,四、单核细胞增生李斯特氏菌的致病因子及致病机理,LM 侵入肌体后可在单核巨噬细胞、肝细胞、内皮细胞及成纤维细胞等多种细胞内存活，生长和繁殖，诱导以CD8+H和CD4+T细胞介导的特异性免疫应答。如CD4+诱导生成淋巴因子（特别是干扰素），CD8+直接裂解感染细胞。但由于LM能在宿主细胞间生长繁殖，因而在很大程度上防止了宿主体液免疫的裂解反应。,四、单核细胞增生李斯

41、特氏菌的致病因子及致病机理（4.4 破坏宿主免疫）,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测,5.1 常用检测方法GB/T 4789.302003；SN 01841993美国FDA一次性增菌检测方法美国USDA/FSIS检测方法ISO检测方法,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.1 常用检测方法）,举例：5.1.1 GB/T 4789.30-2003 食品卫生微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验,检样25g(ml),EB增菌液225ml,LB1增菌液225ml,LB2增菌液10ml,选择性培养基（MMA）,30 48h,30 24h,30 24h,增菌,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.1

42、常用检测方法）,选择性培养基（MMA）,SIM动力培养基,TSI琼脂,TSA-YE培养基,革兰氏染色,运动性观察,MR，VP实验,硝酸盐还原实验,过氧化氢酶实验,甘露醇,木糖醇,鼠李糖,七叶苷,溶血试验,协同溶血试验,小鼠致病力试验,30 24h,30 24h,25 25d（伞状）,30 2448h,5.1.2 FDA检测方法一次增菌培养检测法,检样25g(ml),增菌肉汤225ml,LPM培养基,Oxford培养基,解剖镜镜检,TSA-YE培养基,可疑菌落,生理生化试验及形态检验,30，2448h,35，2448h,30，2448h,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.1 常用检测方法）,

43、Oxford-Agar mit Kolonien von Listeria monocytogenes,30，2448h,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测,5.2 基于免疫学原理的检测技术,原理：ELISA应用举例：FDA批准使用的有Listeria-Tek ELISA和TECHRA可见免疫沉淀试剂盒；加拿大食品检验局(CFIA)批准使用VIDASTM（bioMerieux)LMO1试剂盒和Oxoid Listeria Rapid Test(Clearview)试剂盒检测李斯特氏菌属的菌种；,2003年3月，加拿大批准了VIDASTM（bioMerieux)LMO2用于单核细胞增生李斯特氏菌检

44、测；2003年，加拿大CFIA 批准了BioControl system Inc生产的可见免疫沉淀检测试剂盒用于李斯特氏菌属检测。,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.2 基于免疫学原理的检测技术）,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测,5.3 基于分子生物学原理的检验技术,5.3.1 核酸分子杂交法举例 美国USDA/FSIS和加拿大CFIA都批准使用AccuprobeTM检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒。,DNA探针（化学荧光物质丫啶黄嘌呤标记）,目标菌核糖体RNA,杂交,DNA-RNA,DNA探针,碱性条件下，标记物与过氧化氢作用产生化学发光,内酯键被水解，不发光,用Gen-Probe光

45、度计检测,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.3 基于分子生物学原理的检验技术）,5.3.2 PCR扩增法,加拿大CFIA批准使用PCR检测在相关选择性培养基上得到的可疑单核细胞增生李斯特氏菌菌落。公布的官方扩增基因为hlyA基因，引物核酸序列为：F：5-CATTAGTGGAAAGATGGAATG-3R：5-GTATCCTCCAGAGTGATCG-3 目标DNA大小为730bp.,五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.3 基于分子生物学原理的检验技术）,5.3.3 Real-Time PCR,Real time PCR:即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法。是在PCR反应体系中加入荧光物

46、质，并通过Real time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测，最终对实验数据进行分析处理的方法。,Advantages:(1)Allows us to actually view the increase in the amount of DNA as it is amplified(2)Quantitative(3)No need to run gels:rapid and simpler(4)Multiplexing(1 target per reaction),五、单核细胞增生李斯特氏菌的检测（5.3 基于分子生物学原理的检验技术）,五、单核细胞增生李斯特氏菌

47、的检测（5.3 基于分子生物学原理的检验技术）,Molecular Beacon Technology,Detection of PCR product by molecular beacon,Molecular beacon,TaqMan real-time PCR,Probe with quenching dye and reporter dye,Probe and primer bind target DNA,Reporter dye released from extending double-stranded DNA created by Taq;Light emitted from

48、 reporter dye can byobserved.,TaqMan real-time PCR in Progress,Quantitative Detection of Salmonella by Real-Time PCR,106 105 104 103,Simultaneous detection and quantitation of 3 pathogens in real-time,S.typhimuriumE.coli O157:H7L.monocytogenes,六、李斯特氏菌的预防和控制,预防措施一：保持环境卫生，注意个人卫生，杜绝粪口传播和交叉感染；,预防措施二：忌食长

49、期存放或腐烂变质食品；,预防措施三：李斯特氏菌耐碱不耐酸，怕热不怕冷因此，对冷藏熟食或牛奶的食用安全要注意以下几点：（1）冰箱内保存的食品，存放时间不宜超过1周；（2）冷藏食品应彻底加热后再食用；（3）牛奶最好煮沸后再食用；（4）对肉、乳制品，凉拌菜及盐腌食品等要特别注意食物的卫生。,六、李斯特氏菌的预防和控制,第三节 蜡样芽孢杆菌及其食物中毒,一、概论 在Bergey氏鉴定细菌学手册第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。同昆虫病原菌苏云金杆菌(B.t h u r i n g i e n s i s)，人畜病原菌炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蕈状芽孢杆

50、菌(B.mycoides)、韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)组成芽孢杆菌属，它们的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的D N A 同源性。,1：食源性产芽孢致病菌群基本特征,在外界环境对营养细胞生长不利时，可在胞内形成休眠体（内生孢子）即芽孢；,一、概论,形成的芽孢不能繁殖，但可发芽生长；加热可诱导芽孢发芽或萌发；一些烹饪可杀灭营养细胞，但可诱导芽孢发芽，芽孢发芽变成营养细胞后可开始生长繁殖。,具有对一些逆境如高温和干燥环境产生抗性；一些能杀死营养细胞的化学消毒剂不可渗入芽孢内部；,一、概论（1：食源性产芽孢致病菌群基本特征）,蜡样芽孢杆菌（Bacillus c