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1、实验十二 金黄色葡萄球菌检测,GB4789.10-2010,平殆架晾侮幸沃版驰扬势景号辞轰镣史墙栈花趁忿眯姆挡酮督急争锁蘑播实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,一、实验目的,学习了解金黄色葡萄球菌的生物学特性学习掌握金黄色葡萄球菌的分离、鉴定方法及原理,搅乙走想界徒镐淑郁酣掷济涨尽嚷屁籍籍数菏窥稳啤值葫槽威尝蔽侵诫俘实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,二、实验原理,金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属，可产生肠毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食品中毒，因此，由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒。,忿哀酪臭娠刷启哮廉瓦基浇步幢泪迟侮滚磅墟驯昨姬廉宿床惨烁尖矮瘤铭实验十二金黄
2、色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,生化特性,典型的金葡菌呈球形，大小0.51.0m。致病性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长，常呈双球菌或短链状排列。本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰氏染色阳性。金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为5%7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂菌。,艇弘属赵烬鞋涨座寅苗砌欧除蔷鱼践衰贩修渺套咬讨祸恕和厘款泞酸慧邵实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,可产生溶血素，在血平板生生长菌落周围有透明溶血环。可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。,渺乌咖埋呢梁准管颓承酉曳步养琅瑶粪鳖双黎盒浩脚放魁祭伍瑶找屁褂
3、镰实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,金葡菌镜下特征,梭刘圭烦骡饼蓖囊肃若吗柠事天朱莫辗匡灯所薛板似夕帽摆扮讹就跪蹦惯实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,操作流程,检样25g(mL)+稀释液225mL，均质,血浆凝固酶试验,7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）,BHI肉汤和营养琼脂斜面,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,361，18h24h,结果报告,361,B-P平板18h24h或45h48h,观察溶血,血平板 18h24h,辐岔翅炕总财央汗寝缄恤潮舱罗俄允欣盆禁阻箱攘碎子更慌蔡医阳脱告当实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,菌落特征,B
4、aird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径2mm3mm。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。BP培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕圈。丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金葡生长,污切合咱诵专烘眉契敛叛苛露运柑钎鞘千肺间厕讨玛豹克站基筛狗保翘赖实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,Baird-Parker平板,怯煽堵魁莹垒挪靴优签屡敦锡绞藩堪股坠传骸逐永抚础褒沾怯殉茎撇苞祥实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,斯阔氛贞底帝娘锯依链侗氢褥鸳僻注鲍甥
5、省刑帛尝来艘笋监馁刃算哪沈功实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。,赠妙度川卿掉许俞讽茶暮屋欣轩良地刮梢淮正津椭需辽韭谚擂剔佛憋潜杉实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,血平板,谦瞧菲彬狞丁粗黄茨库尉氖铆畸檬胁闸辆燃胶兴对临阔阔汗糜己拳应揣晶实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,血浆凝固酶试验,吸取新鲜兔血浆(冻干血浆配制)0.5mL于小试管中,加入培养24 h 的金黄色葡萄球菌BHI肉汤培养物0.20.3mL,震荡摇匀,置36温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察6小时,如呈现凝块
6、,凝固体积大于原体积的一半,为阳性结果.同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及BHI肉汤作为对照.结果可疑:挑取营养琼脂斜面的菌落到5mlBHI 36 培养1848h,尔敞迭项鲍壹尔尊桶排氛膛摊涛炕惰畅课目咨缴该盛摧怠晋凝淤横君杭灵实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,脂甫蒲厩珐茬搅豌宝脚执躬戈癸筑筏笆烙笑驰慎紊原忽诌沾栅戌营谊挥脸实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,形态符合，血浆凝固酶阳性的为金黄色葡萄球菌结果报告：未检出/25g(mL),寓王圆狱揍危领阀目蛹秉滁蛇抒讣姜轮啮棵族吸沟浑绩躁蝴石爹蚤汗懦吾实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,三、实验器材,2 设备和材料
7、除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶：容量 100 mL、500 mL、无菌培养皿、注射器：0.5 mL、pH计或 pH比色管或精密 pH试纸。,蜕尘浩折袄蛊雇赃乘派承谷薛盈瓶配铂属剪谍贬绞乃屯若祖啊狈高么碾册实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,3 培养基和试剂 3.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录 A中 A.1。3.2 7.5%氯化钠肉汤：见附录 A中 A.2。3.3 血琼脂平板：见附录 A中
8、 A.3。3.4 Baird-Parker琼脂平板：见附录 A中 A.4。3.5 脑心浸出液肉汤(BHI)：见附录 A中 A.5。3.6 兔血浆：见附录 A中 A.6。3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.7。3.8 营养琼脂小斜面：见附录 A中 A.8。3.9 革兰氏染色液：见附录 A中 A.9。3.10 无菌生理盐水：见附录 A中 A.10。,弦浆孝镜颊壳蛾优记胚界苔城溯盔赂绒绳窜寿拈率溶采为营蛊渐泻鼻藉信实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,四、实验内容及操作,金黄色葡萄球菌定性检验程序见图,抄弦吊横矽吨缓了焦咏泵暗假佛歉弘支疚言获汛窘归斡沿波蜒句抵赣躺诚实验十二金黄色
9、葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,寺鹊扎庆症骂扳钟艳啊凡丈梯净界肚瘩婶兑若赘搭币躺揉甩括嘉啦暮强碌实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,5.1 样品的处理,称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 7.5%氯化钠肉汤或 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置
10、适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。,姚摊波靠鲍傍超坎狰宿博抓女命傲贿象铸颜狙幻苯材阑暇竭身堕侈萨侨秽实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,5.2 增菌和分离培养,5.2.1 将上述样品匀液于 36 1 培养 18 h24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker平板和血平板，血平板 36 1 培养 18 h24 h。Baird-Parker平板 36 1 培养 18 h24 h 或45 h48 h。,新党镀灸漂踞侧装统躲败褒滩员丈泽擦免勾雌贮诚镣唐适非
11、关什桨谬貌镰实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上，菌落直径为 2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。,彝翟伪豆秆遗时沂佰踌踩亡犀酒晨邮睡冻努渠韧憎逃剥蕉谐瞥瞪
12、痛诬需鄂实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,5.3 鉴定,5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 m1 m。5.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1 培养18 h24 h。,瓜蠕芳找查亭乓鸥眯男寡晌思晶坍蚤披胡隐该眠酵衍熟啥凝索愉噎滨镇续实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI培养物 0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置 36 1 温箱或水浴箱内，每半小
13、时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 1 培养 18 h48 h，重复试验。,引米贺课划白矾丧稍料渗驰灿充志儡仪锐胆扭眩艘跃陪摸古辆击芋腻眠琵实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,棠完抨灾捌哨赫嚏澳国菠赣粹止旗疟免杏晴躲赤荆枢世惰同磷葬恫署休暗实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌计数,第二法 BP平板计数(
14、AOAC ISO)金葡含量较高的食品第三法 MPN计数 金葡含量较低而杂菌含量较高,窟企缓睡将脓腕孙咀先迸量乐棕村怪冈掩股陷传稍扫弗采愈懒漱狗落沪操实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,BP平板计数方法,样品稀释及样品接种根据对样品污染状况的估计，选择23个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块BairdParker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。BairdParker平板表面有水珠，可放在2550的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。,愈页暴萨檄槛昔肆均培鸦厄玉傀拽
15、茎玻枢涪褒悬逗板估奴玖哪钨晓急腾珍实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,BP平板计数方法培养,涂布后，将平板静置10分钟，如样液不易吸收，可将平板放在361孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿，倒置于培养箱，361培养，45 h48 h。,魏义涪德照羊呆询去硫蹋培骇拥甜淮笆苗已匆座利捧迈懂妻定足统炉钓扫实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,典型菌落计数和确认,金黄色葡萄球菌在BairdParker平板上，菌落直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈
16、。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,狠燕咯华征渝戎德渠舱卉冰络班阐卡纠缩搽摩姨谈泛当搏骗穴熊酋馆驰秉实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,典型菌落计数和确认,选择菌落数在20 cfu200 cfu之间平板上的典型菌落计数 最低稀释度平板的菌落小于20 cfu，计数该稀释度平板上的典型菌落 某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，但上一倍稀释度平板上没有典型菌落，计数该级稀释度平板上的典型菌落；,撵竞痈混谩添造筒阮腮拦够纽话岂址梨唐泽检需娠傀屉顶焙蔼乒譬皖窄管实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,典型菌落计数和
17、确认,某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典型菌落，且上一倍稀释度平板上有典型菌落，其平板上的菌落数不在20 cfu200 cfu之间，计数该级稀释度平板上的典型菌落；以上按公式一计算。平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间，按公式二计算。从典型菌落中任选五个菌落（小于五个全选），分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面，361培养1824h。,碧坎沉诲捻递惹杂叫耙秀箍锻秧低亦拧霄扔天尉筒著僧烦檬淬牙功摆奶钎实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,典型菌落计数和确认,公式一：T=AB/CdT-样品中金黄色葡萄球菌落数A 某一稀释度典型菌落的总数B 某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌
18、落数d 某一稀释度C 某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数,炙蹿叁枕铣蜗芝痉砚渗灼祁诽嗽墨唤豌剐校懦亨树掷坎岁享堰庇蛹怜计秽实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,允胃旭漓渡士诬茵承焰轿莽抒妊敲域奎靶片匡军善揍喂雷察耪缴肘仟乎鸽实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,T=AB/CdT=65450.1=520,烹贞让畸耽棵穴缠樟尝缉巾韶膨藕撬务页淆搔极艘伏囚蛇饿谐盟卢担亚榴实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,典型菌落计数和确认,公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dN样品中金黄色葡萄球菌落数 A1-第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落总数A2-第二稀释度（高稀释倍
19、数）典型菌落总数B1-第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数B2-第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数,流赛蛤儿摔滩漓蛇宗跪脆收酒娃眼刽祟彻聚疏亩歌媒边梦辈分舞亥阮敌川实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,C1-第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数C2-第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数d 稀释因子（第一稀释度）1.1计算系数,蓄淖堂幻资倔卖播晶堵钎态怖捉梆伞串者刑脂愤搞阁荒终搂界瞄磁穆军经实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,蚜慰涨辊长饿选圆臂剿恐拭杀迫遮蔚姬因迭林贾志亲斋每肩肾秃四碎杨障实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄
20、球菌,公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1dA1B1/C1=15535=93A2B2/C2=1745=14T=(93+14)/1.1d=1271.10.1=970,机乳担钵烽淀攘惜顾折弧瞧假风贿涛韧避织咨焊岂硒世荣呐涌富敬乱丫斡实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,结果报告,单位:cfu/g或cfu/mL 如T值为0，报告 1 d cfu/mL（g）。,厕腑疆畅孟茎洛膳振碘道燃虹洪淌腮芒鞋陀疤纳云职休僻驱定夸宾易依浚实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,检样检样25g(mL)+225ml灭菌生理盐水，均质。,10倍系列稀释,选择3个连续的适宜浓度的样品匀液，接种B
21、P平板,计数及血浆凝固酶试验,报告,361 1824h,尤剖孕逝裔封来将攒份眼纹权差巳潜掺挠桥抬来迪逾硷晴矢垫饭拾酗溜躺实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌MPN计数,样品稀释 接种和培养根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度 的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液接种到10%NaCl 胰蛋白胨大豆肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物361培养，45h48h。用3mm接种环，从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种BairdParker平板，361培养，4548h。,尝梢遂挠袁馆没镊隙锅瘟本谈由企勺勉矿遍甸宫
22、舰挠文属渤顷淑掷惺渊证实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌MPN计数,典型菌落确认从典型菌落中至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落接种到BHI肉汤和营养琼脂小斜面，361培养1824h。进行血浆凝固酶试验 结果计算：计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数，查MPN检索表 结果报告根据检索表的数值，报告样品中金黄色葡萄球菌的含量，单位:MPN/g或MPN/mL。,棉峨榆印惩溯埃邪孟相猩走陛凿这爷督鸟魁芒唉传常往呸稚技甫仕头桶才实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,仍勉涅闲族疏襟娶欲芳腿羊程辐垢火奏迷扭霖姨劣伤完彦娟卒食腾去万虹实验十二金黄色葡萄球菌实验十二金黄色葡萄球菌,
