《基因工程的概念.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因工程的概念.ppt（64页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、Chapter 15 Recombinant DNA and Genetic Engineering,基础理论和技术的发展催生了基因工程,15.1 基因工程的概念,一、基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中 分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然 后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分 子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过 程.,基因工程(gene engineering)常和以下名称混用,遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning)
2、;基因操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.,15.1 基因工程的概念,二、基因工程的主要内容或（步骤）,1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了
3、重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。,15.1 基因工程的概念,三、基因工程的应用,医药：生物制药；基因治疗；人工器官农业和畜牧业 转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、高品质新品种 转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品 生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质轻工与食品 新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶 环境 污染治理；废物利用；污染物生物降解,15.1 基因工程的概念,
4、15.1 基因工程的概念,转基因植物,15.1 基因工程的概念,转基因动物作为生物发生器,15.1 基因工程的概念,15.2 基因工程中的工具酶,限制性内切酶主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶用于DNA分子的甲基化 核酸酶用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等,15.2 基因工程中的工具酶,一、限制性内切酶,（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizom
5、er，同裂酶）（五）、限制酶的用途,15.2 基因工程中的工具酶,一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列；并在特定切点切割,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,来源：,种类：,作用：,主要是微生物,4000种。,15.2 基因工程中的工具酶,（一）、限制修饰系统的种类,1.型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.型：限制与修饰基因产物独立起作用，在.c
6、oli中这两种基因位于质粒上。3.型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。,15.2 基因工程中的工具酶,（二）、限制性内切酶的定义、命名,1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：Hind前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“”表示菌系为型血清型；“”表示分离到的第三个限制酶。EcoRIEscherichia coli RI,15.2 基因工程中的工具酶,（三）、
7、限制酶的特点,1.识别顺序和酶切位点）识别-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG）富含）对称性双对称 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5）切点大多数在识别顺序之内，也有例外）限制酶切后产生两个末端，末端结构是-和-,15.2 基因工程中的工具酶,2.末端种类）-端突起，个数为或个核苷酸 Pst I 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-
8、GACGTC-5 3-G ACGTC-5）-端突起，个数为或个核苷酸 EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5 粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别 位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行 DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘 性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子,15.2 基因工程中的工具酶,EcoR 5-G-A-A-T-T-C-3 3-C-T-T-A-A-G-5,Palindrome,5-GOH PAATTC-3 3-CTT
9、AAP HOG-5,Cohesive Ends(Sticky Ends),15.2 基因工程中的工具酶,SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5,Blunt Ends,15.2 基因工程中的工具酶,）平齐末端 SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5）非互补的粘性末端）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5-GGATG()9-3 5-GGATG(N)9 3-CCTAC()13-5 3-CCTAC(N)13）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5-CPyCGP
10、uG-3 CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG,15.2 基因工程中的工具酶,（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）,1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶 2.特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG,15.2 基因工程中的工具酶,（五）、限制酶的用途,1.DNA重组 2.限制酶（物理）图谱绘制 3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点 1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。
11、2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1-20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1-5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47108 kD。,15.2 基因工程中的工具酶,Restriction Maps(a),15.2 基因工程中的工具酶,Restriction Maps(b),15.2 基因工程中的工具酶,15.2 基因工程中的工具酶,二、DNA聚合酶,（一）、E.coli DNA聚合酶I（pol）1.E.coli 的DNA聚合酶系统 Pol 参与DNA修复,具35和53外切酶活性 pol 同上 具35外切酶活性 pol 参与DNA复制,具3
12、5和53外切酶活性 2.E.coli pol的特点 1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具35外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，53,要求3-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3）外切酶活性,15.2 基因工程中的工具酶,3.用途 1）除去3-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5-突起端 3）合成第二条cDNA 4）切口移位制备探针 其中用途2)和3)常用大片段,15.2 基因工程中的工具酶,三、连接酶,（一）、T4 DNA连接酶 1.特点：只连接ds
13、-DNA分子，要求3-羟基和5-磷酸基 2.用途：1)相同或相容粘性末端的连接 2)平整末端的相连 DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多,15.2 基因工程中的工具酶,5-AAGCTT-3 5-AOH PAGCTT-3 PAGCTT AOH3-TTCGAA-5 3-TTCGAP HOA-5 HOA TTCGAP 退火 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOHA-5 或 5-AHOPAGCT T AHOPAGCT T-3 3-T TCGAPOHA T TCGAPOH
14、A-5 T4 DNA连接酶 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5 或 5-AAGCTT AAGCTT-3 3-TTCGAA TTCGAA-5,T4 DNA连接酶的连接反应(两种插入方向),+,The polymerase chain reaction(PCR)：to amplify a sequence of DNA using a pair of primers each complementary to one end of the the DNA target sequence.1985年，美国Cetus 公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技
15、术。,15.3 Polymerase Chain Reaction,Denaturation（变性）:The target DNA(template)is separated into two stands by heating to 95Primer annealing（引物退火）:The temperature is reduced to around 55 to allow the primers to anneal.Polymerization(elongation,extension):The temperature is increased to 72 for optimal po
16、lymerization step which uses up dNTPs and required Mg+,15.3 Polymerase Chain Reaction,15.4 Vectors,一、质粒的一般生物学特性；二、质粒DNA的分离与纯化；三、质粒载体的构建及类型；四、常用质粒载体举例；,一、质粒的一般生物学特性,（一）、质粒DNA1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又
17、会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。,（二）、质粒的拷贝数与不亲和性,1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个
18、）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。,15.4 Vectors,二、质粒DNA的分离与纯化,15.4 Vectors,三、质粒载体的构建及类型,（一）质粒载体的发展概况；（二）质粒载体的特点（基本条件）；（三）遗传标记基因（四）质粒载体的类型,15.4 Vectors,（一）发展概况,1.第一阶段（1977年前）
19、：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivar et al)2.第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,15.4 Vectors,（二）载体特点,1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3、至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、
20、具有较小的分子量和较高的拷贝数。注：前三个特点必不可少。,（三）遗传标记基因,1、标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。*这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS，lacZ），绝大多数为后者。*有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。,2、标记基因的种类 1
21、）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1)四环素抗性基因（Tetr，Tcr）Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。2)氨苄青霉素抗性基因（Ampr，Apr）Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割
22、氨苄青霉素的内酰胺环，使氨苄青霉素失活。,3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。,5）半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ）半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有
23、酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。lacZ（lacZ）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的lacZ基因产物（链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ-肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶
24、活性，菌落呈白色。半乳糖苷酶基因的优点:a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b.lacZ编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c.lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,LacZ基因的结构与产物,（四）、质粒载体的类型,1、根据载体的分子生物学特性划分（1）.质粒型载体环状dsDNA分子，自主复制（2）.病毒型载体环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒（3）.混合型载体具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性,15.4 Vectors,2、根据载体功能划分（1）.普通型载体 1)特点:至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一
25、 个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。2)用途:基因组或cDNA文库的构建;次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。例子:pBR322和pUC载体。上述两例中的非重组子来源有两个：a.酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子 b.酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子,15.4 Vectors,pUC18和pUC19载体,普通型载体pBR322的结构图,（2）、表达型载体（expression vector）1)特点:a.基因的启动子序列和终止子序列；b.一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子
26、量差异）。2)结构:a.转化单元-宿主细胞转化 b.表达单元-外源基因表达 3)类型:型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子 型:转录起始区终止子+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子 型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）,15.4 Vectors,三种表达型载体结构图,15.4 Vectors,Plasmids Easy to use and store.Recombinant plasmids readily selected with antibiotics.Lambda phage Useful for cloning large
27、(15-20Kb fragments).Cosmids Combined plasmid/phage vector permits cloning of even larger(e.g.45Kb)DNA fragments.Yeast plasmids Permit direct studies on eukaryotic gene regulation.Plant plasmids Bacterial(Agrobacterium)infection of plant transfers Ti plasmid into host plant cells.,Type of Vector Adva
28、ntage,四、常用质粒载体举例,1、pBR322载体2、pUC载体,15.4 Vectors,1、pBR322载体,优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,15.4 Vectors,利用抗生素抗性基因筛选重组子的过程,筛选重组子的示意图,2、pUC18和pUC19,pUC系列质粒载体具有三个显著特点：（1）、分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（
29、不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。（2）、含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）、多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端，进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,15.4 Vectors,pUC18和pUC19载体,利用菌落颜色筛选重组子,15.4 Cloning Strategies for Identifying Specific Genes,DNA片段扩增,找出,目的基因细胞,目的基因,mRNA,逆转录,单链DNA,合成,双链DNA,获取目的基因的方法,重组DNA操作过程示意图,15.4 Cloning Strategies for Identifying Specific Genes,
