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1、1,微生物限度检验方法验证,2007.4,2,微生物限度检查(Microbial Limits Test)：,是指非无菌制剂及原，辅料受到微生物污染程度的检查。包括：1）细菌计数；2）霉菌及酵母菌计数；3）控制菌检查：大肠杆菌，沙门菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，大肠菌群,3,细菌、霉菌及酵母菌计数,4,控制菌检查(EP),5,控制菌检查(USP),6,控制菌的检测(中国药典05版),7,05版微生物限度检查法与英美比较,8,验证目的,-在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样品（药品）中有一定数量的微生物存在，那么采用此法可以使得样品（药品）中的微生物得以检出。-充分验证样品（药品）本身
2、对微生物生长的影响。,9,验证目的,确认一种检验方法。验证实验 检验条件 检验方法,样品量稀释液种类稀释液体积中和剂培养基培养时间培养温度,SOP,检验规程,10,影响微生物检验的因素,-样品/药品自身的特殊性-样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂-培养基的特性-培养条件-人员因素-实验器材的选择,11,恢复试验,-微生物方法验证的实质就是评价和考察微生物恢复试验（恢复生长）的可信度。-恢复试验就是确认某一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物都能够恢复生长。,12,验证内容（一）计数方法验证（二）控制菌检验方法验证,13,微生物限度检验方法验证（一）计数方法验证,14,供试液制备（中国药典200
3、5版）,-表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。-供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。-供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。-供试液的体积：100ml。,15,稀释剂（中国药典2005版）,（1）pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（2）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（3）pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml,16,微生物计数方法验证菌种选择原则,普遍性-G+、G-、-杆菌（长、短杆菌）-球菌-真菌（丝状真菌、酵母菌）特殊性-从环境中分离出来的常见杂菌-从样品中分离出来的常
4、见杂菌,17,微生物计数方法验证用菌株：中国药典2005版,菌株名称 CMCC编号 培养条件 大肠埃希氏菌(E.coli)CMCC(B)44102 金黄色葡萄球菌(Sta.aureus)CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌（Bac.subtilis）CMCC(B)63501 白色念珠菌(Can.albicans)CMCC(F)98001 黑曲霉菌(Asp.niger)CMCC(F)98003,营养肉汤培养基 30-35 18-24h,改良马丁培养基 20-25 18-24h,改良马丁斜面培养基 20-25 5-7天,18,微生物计数方法验证用菌株：USP29版,菌株名称 ATCC编号 培养条
5、件 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 8739 32+2.5 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538 32+2.5 铜绿假单胞菌(Staphylococcus aureus)ATCC9027 32+2.5 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC11437 32+2.5 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633 22+2.5 白色年珠菌(Candida albicans)ATCC10231 22+2.5 黑曲霉菌(Candida albicans)ATCC16404 22+2.5,
6、19,计数方法验证步骤,选定一个方法 确定检测限设计验证方案,20,样品的选择：,合格的样品-按照正常取样方法取样的样品-符合限度标准的样品,21,检测限：样品中细菌被检出的最低量。,细菌 100 cfu/ml 霉菌、酵母菌 100 cfu/ml,22,恢复试验的原则,-消除样品的抑菌性-样品的处理方法和检验方法不应影响样品中微生物的生长,23,如何消抑菌活性,-稀释法-中和法-离心法-薄膜过滤法-组合运用,24,计数方法验证（平板法）,样品组：样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml稀释剂对照组：蛋白胨稀释液 9.9ml（阴性对照）104 cfu/ml菌悬液
7、0.1 ml 菌种组：104 102（阳性对照）空白样品组：,计数A,计数B,计数C,计数D,25,结果判断依据：,1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作正确。没有污染事件发生。,26,可以接受的标准 平板法,1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：无污染事件发生-样品组（回收率）：A=C
8、 30%（偏差 30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符,27,计数方法的验证-各国药典结果判断标准,USP：各试验菌的回收率均不低于70%。EP、BP、JP:各试验菌的回收率均不低于80%。2005版中国药典：各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%。,28,不可以接受的标准：,1、阴性对照：阴性对照(包括蛋白胨组和空白样品组)发生污染事件。菌落鉴别：-污染菌是测试菌：检验员无菌操作培训。-污染菌不是测试菌：偏差调查。2、阳性对照：样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。,2
9、9,不可以接受的标准：,3、样品组：-三人三次的试验结果应该与检测限相符。-第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的试验证实。-任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程有缺陷，验证需重新进行。,30,优化更新步骤：,消除抑菌活性。稀释样品时，应确认检测限（检验限度）低于或等于标准。不同的细菌，一个好的结果可以从不同的稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于日常的监测中。,31,平板法优化更新方法：,稀释样品：1/10 1/50 1/100 增加培养基量延长培养时间添加抗活性剂,32,计数方法验证（薄膜过滤法）,样品组：样品溶液（1/10）10ml 过滤 5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml
10、蛋白胨对照组：蛋白胨稀释液 10ml 过滤（阴性对照）5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌种组：5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤（阳性对照）空白样品组：过滤,计数A,计数B,计数D,计数C,33,可以接受的标准 薄膜过滤法,1、重现性良好-三批不同批次的样品/产品-三次独立的试验2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：没有污染事件发生。-样品组：B=A+30%（偏差 30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符,34,薄膜过滤法优化更新方法：,增加冲洗量 增大样品稀释倍数（1/50，1/100）延长培养时间添加抗活性剂（冲洗剂里加也可以）,35,微
11、生物检验方法验证（二）控制菌检验方法验证,36,控制菌检验方法验证菌种选择原则,样品的给药途径和类型决定了采用何种控制菌检查验证。,37,增菌培养基的确定,增菌培养基的实际用量等同控制菌检查方法验证时的用量。验证的开始。,38,控制菌检验方法验证,选定一个方法：CP或USP 设定检测限：不得检出设计验证方案,39,控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）,增菌（计数）,样品组,蛋白胨对照,菌悬液对照,样品100ml增菌液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu/ml,大肠杆菌悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml,蛋白胨100ml 增菌液 大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu
12、/ml,培 养,样品组,空白样品对照,40,控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）,确认培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检，必要时要鉴别。,4 组测试样品,观察,CP法,USP法,18小时,24小时,41,结果判断依据：,1、样品组和蛋白胨对照组测试结果一致，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、蛋白胨对照组和菌种组测试结果一致，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作正确。没有污染事件发生。,42,可以接受的标准,1、样品检验-增菌液经培养后明显浑浊-分离平板
13、上出现大肠杆菌的典型菌落2、阳性对照-增菌液经培养后必须是浑浊的-分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落3、阳性菌计数-菌悬液的计数结果应该 100 cfu,43,不可以接受的标准（无效试验）,1、样品检验-与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤2、阳性对照-与可接受的标准不符 结论：重新试验3、阳性菌计数-与标准不符 结论：重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作新的菌悬液直到符合规定。,44,优化控制菌验证步骤：,扩大增菌液的体积 100ml 200ml 300ml 400ml 500ml延长增菌液的培养时间采用薄膜过滤法加入活性试剂,45,控制菌检验方法验证（薄膜过滤法）（以大肠杆菌为例）,加10
14、ml 稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。加100ml 样品增菌液到薄膜过滤器中。加0.1ml、5X102 cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该有50 cfu个菌落出现。,46,失败的验证（无效试验）,1、样品中有些成分是固有的抑菌成分2、参考防腐剂的实验/验证数据3、参考样品中各成分的理化性质,47,验证结果,根据验证结果，判断是否符合验证的标准。符合 按验证的方法和条件继续进行药品的微生物限度检查；不符合 重新设计验证方案，再进行验证，直至验证结果全部符合验证方案。,48,验证报告的形成,1、全部验证工作必须按照批准的验证方 案进行。2、验证方案批准后，可
15、以进一步再修订，但必须在验证报告上注明。3、验证结束后，应该同时出具验证数据 记录和验证报告。4、最终样品稀释度及方法必须在SOP中 说明。,49,采用薄膜过滤法的供试品,（1）水溶液（2）可溶于水的固体制剂（3）-内酰胺类抗生素 非水溶性制剂（1）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂（2）无菌气（喷）雾剂 装有药物的注射器（3）具有导管的医疗器具(输血、输液袋等),50,方法验证的关键点（1）,对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的实验人员的测定结果的可能有很大的误差，甚至达到50%。所以，在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。,51,方法验证的关键点（2）,当采用固体培养基上
16、的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。,52,方法验证的关键点（3）,为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍梯度稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度，将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管应接触试管内壁并靠近液面（勿接触液面），缓慢地沿管壁放出全部菌液，然后，将吸管放入消毒液中。再取一支灭菌吸管同法往下稀释。,53,实例(摘自中检所抗生素工作网站）,头孢羟氨苄片微生物限度检查法双黄连口服液微生物限度检查法,54,谢 谢！,
