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1、第九章植物体细胞无性系变异与突变体的筛选,本章学习重点,影响体细胞无性系变异的因素；体细胞无性系突变体的筛选程序。,第一节植物体细胞无性系变异,一、体细胞无性系变异的普遍性二、体细胞无性系变异的类型三、体细胞无性系变异的遗传基础四、体细胞无性系变异的诱导,一、体细胞无性系变异的普遍性,离体培养所产生的再生植株统称为体细胞无性系。体细胞无性系变异是指在离体培养再生植株上表现出来的变异，有时也指培养物（细胞或愈伤组织等）表现出来的变异。,主要表现为:植株外部形态变异；育性上的变异；生长势上的变异；抗逆性变异；次生代谢物的差异。,可以通过有性世代和无性繁殖世代稳定保持的变异。,二、体细胞无性系变异的
2、类型,遗传变异非遗传变异,是指由于某种外界条件存在而引起的性状变异，这种变异会随着特定外界因素的消失而消失。,又称为表观遗传变异，是指由于外部影响导致基因表达的改变，从而引起表型上的变异，在有性世代和无性世代都不能稳定保持。,三、体细胞无性系变异的遗传基础,1.染色体数目变异2.染色体结构变异3.基因突变4.基因扩增5.基因丢失7.DNA碱基修饰8.转座子的激活9.基因重排,在离体培养条件下，植物细胞基因中的某些碱基序列丢失而导致基因失活。,一些基因中的某些位置甲基化后，其基因就会表现为不活跃的非表达基因，而当这些位置去甲基化后，则活跃表达。,是指DNA分子内部核苷酸序列的重新排列，起源于DN
3、A复制过程中的同源染色体重组和缺失、倒位及插入。,四、体细胞无性系变异的诱导,自发变异人工诱发变异,（一）自发变异,在植物组织培养中，经常能发现某些再生植株在形态、性状等方面与原来亲本性状不同的变异。离体培养再生植株的自发变异远远大于自然变异（10-7-10-6），体细胞无性系变异的变异率可以高达30-40%，有时甚至高达100%，某一具体性状的变异率在0.2-3%之间。,影响体细胞无性系变异的因素,供体植物的遗传背景,外植体的类型及生理状态,培养基,继代次数,植株的再生方式,外植体细胞中预先存在的变异,以分化程度较高的组织或细胞为外植体，在较高的激素浓度条件下诱导愈伤组织，并经过较长时间的继
4、代培养，然后再分化形成再生植株，有可能得到较高频率的体细胞无性系变异。,（二）人工诱发变异,1.物理诱变 以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的射线、中子等进行辐射。以细胞或原生质体，则可选择X射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料时，可以使用紫外线照射。,2.化学诱变,常用的化学诱变剂有：碱基类似物：核酸复制时，可掺入到新合成的DNA分子中引起错配，如8-氨基鸟嘌呤；烷化剂：如环氧乙烷，可引起DNA的碱基烷化，从而造成碱基错误配对；DNA分子结构插入物：如亚硝酸，可改变遗传密码的阅读顺序而导致突变。,第二节 植物体细胞无性系突变体的筛选,一、突变体的筛选方法二、突变体筛选的一般程序
5、三、植物体细胞无性系变异的应用,一、突变体的筛选方法,田间表型选择法离体筛选绿岛法,（一）田间表型选择法,即从田间栽培的大量再生植株中筛选出优良变异单株。工作量虽然大，但较为简单，能直观表现性状变化，利于直接判断改良性状。目前育成的有关品种多是采用这一方法获得的。,（二）离体筛选1.直接筛选法,直接向培养基中加入盐类、除草剂、重金属、抗生素等，或采用干旱或冷、热和冰冻处理，获得抗性愈伤组织或抗性细胞系。,贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4%NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。,2.间接选择法,是一种借助于与突变表现有关的性状作为选择指标或筛选压的筛选方法。,林定波等将锦橙株
6、心细胞愈伤组织的悬浮细胞经射线照射，然后在高浓度脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，其再生植株抗寒性比供体植株提高2.4。,（三）绿岛法,射线,使用除草剂后叶片上出现绿岛,切下绿色部位经培养产生抗性植株,二、突变体筛选的一般程序,诱变材料的选择,诱发突变,突变细胞的筛选,细胞增殖与植株再生,突变体稳定性鉴定,三、植物体细胞无性系变异的应用,改良作物品种拓宽种质资源,筛选高产细胞株提高次生代谢物产量,Thank You!,基因突变,DNA碱基序列中单个或多个碱基对发生的变化，包括碱基序列替换、插入、缺失等。基因突变被认为是体细胞无性系变异的重要来源之一。植物组织和细胞经离体培养
7、后，在愈伤组织的脱分化和再分化过程中常常会引起基因发生突变。,基因扩增,细胞内某些特定基因的拷贝数专一性地大量增加的现象，是细胞在短期内为满足某种需要而产生足够的基因产物的一种调控手段。,转座子,转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。,转座子的激活,转座子活化可以引起基因表达的广泛变化，因此无性系变异频率才如此之高。转座子具有使不活动的结构基因活化的特点，因此会有显性突变。转座子还可使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，即基因放大。,供体植物的遗传背景,基因型：不同物种、不同品种的外植体，其变异频率差
8、异较大。倍性水平：多倍体和染色体数目较多的植物，其变异频率比二倍体和单倍体高。,外植体的类型,再生植株的变异频率：原生质体培养的再生植株细胞培养组织、器官培养性细胞培养的再生植株体细胞培养,外植体的生理状态,同一种植物不同部位的外植体，变异频率不同；分化程度较高的组织产生的再生植株更容易发生变异：以分生组织为外植体的再生植株变异频率很低；以分化组织为外植体的再生植株容易发生变异。,植物激素,高浓度的细胞分裂素（6-BA）往往会引起体细胞基因突变、染色体的丢失等现象；高浓度的GA和IAA往往会造成畸形胚的高频发生；TDZ使再生植株大多是白化苗或玻璃化苗。,培养基物理状态,一般来讲，悬浮培养的细胞
9、较固体培养的细胞易产生变异。,继代次数,由继代次数引起的体细胞变异普遍存在。一般来说，培养时间越长，继代次数越多，细胞变异的几率就越高。,植株的再生方式,（1）由体细胞胚形成的再生植株变异性远小于由器官发生途径形成的植株；（2）直接再生植株遗传稳定性较好；经过愈伤组织阶段形成的再生植株则容易发生变异。,一般需考虑以下几方面的问题：避免采用不能再生或难以再生的材料；要选用染色体稳定的细胞系进行起始诱导；要选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状。,1.诱变材料的选择,培养细胞的来源,愈伤组织 悬浮细胞 原生质体,优点：取材方便缺点：生长较悬浮细胞慢；接触选择剂不均匀；聚集体较大，
10、抗性细胞不易正常生长；物理或化学诱变作用不均一。,广泛采用的材料；缺点：存在细胞聚集现象，影响诱变效果。,优点：是单细胞，容易被选择剂选择，可避免产生嵌合体；缺点是植株再生困难。,2.诱发突变,当诱变处理时，可在培养基中加入诱变剂，诱变处理后用大量稀释法或用解毒剂终止诱变剂的作用。诱变处理的另一种方法是先在植株水平上进行诱变处理，再在组织培养中筛选。,5.突变体稳定性鉴定,（1）选择出来的细胞或组织放在正常培养基中继代几次，仍表现变异性状者为突变体；（2）再生植株水平鉴定：形态学、生理生化鉴定，染色体观察和核型分析，同工酶谱分析，分子标记等（3）再生植株后代鉴定,第十章植物种质资源的离体保存,
11、本章学习重点,超低温保存的基本程序超低温保存的冷冻处理方法,第十章,一、概 述,种质：是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代的遗传物质。种质资源：携带各种不同遗传物质的植物的总称，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。,种质（资源）保存,利用天然或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。,种质资源保存的方式,原生境保存：建立保护区和保护地非原生境保存：异地保存（种质圃和植物园保存）、种质库保存、离体保存,种质资源离体保存,指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处
12、理使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。,种质资源离体保存的优点,占用空间少，节省人力、物力和土地；便于种质资源的交流利用及濒危物种挽救和快繁；需要时，可以利用离体培养方法很快大量繁殖；避免自然灾害引起的种质丢失。,二、常温限制生长保存,（一）高渗保存法（二）生长抑制剂保存法（三）降低氧分压保存法（四）饥饿法（五）干燥保存法,链 接,三、低温保存法,一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度来限制培养物各种生长因子的作用，使培养物生长减少到最低限度，延长继代的时间间隔。一般在1-9（一些热带、亚热带植物在10-20）下培养，一般一年继代一次。,三、超低温保存,是指将植物的离体材料
13、经过一定的方法处理后在超低温（-196液氮）条件下进行保存的方法。,（一）基本原理,离体材料在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长基本处于停止的状态，当解冻后，又能恢复再生能力。,超低温保存时，降温冷冻和解冻过程中容易引起植物材料的伤害：,细胞脱水过度，引起“溶液效应”；细胞液态水减少，引起质膜系统受损；细胞内水分结冰，形成冰晶，直接破坏细胞结构。,（二）冷冻防护剂,植物细胞含水量大，投放液氮中易引起组织和细胞死亡，故须借助于冷冻防护剂，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏。,提高溶液粘滞性，阻止冰晶形成；增加细胞膜透性，加速胞内水分向外渗出；防止“溶液效应”的毒害；稳定细胞内大分子的正常
14、结构，阻止低温对膜的伤害。,冷冻防护剂的种类,渗透型冷冻防护剂：DMSO、GA、EG、乙酰胺、PG等；非渗透型冷冻防护剂：PVP、蔗糖、葡聚糖、PEG等。,（三）超低温保存的基本程序,1.保存材料的选取2.材料预处理3.冷冻处理和冷冻储存4.解冻5.再培养6.超低温保存后细胞或组织活力检测,1.保存材料的选取,茎尖（芽）、腋芽原基、体细胞胚等是理想的离体保存材料。,选取材料应考虑：再生能力 遗传稳定性 抗冻性,2.材料预处理,（1）加速继代：新分裂细胞含自由水少，不易形成大冰晶（2）提高培养基渗透压：提高细胞的渗透压（3）添加冷冻防护剂：5%-8%DMSO（4）低温预处理：0-4低温锻炼,3.
15、冷冻处理和冷冻储存,（1）传统的降温冷冻方法（2）玻璃化保存法（3）包埋脱水法超低温保存（4）包埋玻璃化法超低温保存,链 接,4.解 冻,直接投入37-40水浴中解冻,置于0或2-3的低温下慢慢解冻,原冷冻速度超过-15/min的材料；液泡小、含水量少的细胞,液泡大、含水量高的细胞；木本植物的冬眠芽,5.再培养,保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害，然后在固体培养基上进行培养，使材料恢复生长，并再生植株。,6.超低温保存后细胞或组织活力检测,细胞活力检测再培养的存活率遗传稳定性检测,Thank You!,影响培养基凝固的因素：,琼脂的量及质量 培养基的pH值 高压灭
16、菌的温度 高压灭菌的时间,总结：,以下现象或动作容易引起污染：,1.在接种室内大声说话2.用手挠头3.头部伸进超净工作台内4.双手交叉取物5.手或手臂从培养基、培养皿、灭菌材料、接种工具等上方经过6.金属架、接种工具灼烧灭菌的时间不够 7.接种工具插入接种器具消毒器内的深度不够8.接种时试管或三角瓶不拿成斜角9.已灭菌的材料或物品拿到超净工作台外后又返回10.每次灭菌的材料过多11.植物材料接触试管口或瓶口12.已灭菌的材料掉落台面后又捡回接种13.接种工具接触瓶口或其他带菌物品后未重新灭菌就接种14.打开瓶口或封瓶口时瓶口未过火,（一）高渗保存法,通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长的
17、保存方法。渗透压调节物质：蔗糖、甘露醇、山梨醇、PEG等,（二）生长抑制剂保存法,在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。生长抑制剂：ABA、青鲜素、CCC、B9、PP333等,多效唑浓度依次为0、0.1、0.5、1.0mg/L,矮壮素浓度依次为0、100、300、500mg/L,（三）降低氧分压保存法,降低培养容器内的氧分压，改变培养环境的气体状况、抑制细胞的生理活性、延缓衰老。,（四）饥饿法,减去培养基中的一种或几种营养元素，或降低某些营养物质的浓度，使植株处于最小生长阶段。,（五）干燥保存法,对愈伤组织或体细胞胚进行脱水处理，然后置于特定的培养基条件
18、下保存。,返 回,（1）传统的降温冷冻方法,B,C,A,慢速冷冻法,快速冷冻法,两步冷冻法,逐级冷冻法,D,A.快速冷冻法,从0或其他预培养温度直接投入液氮中保存，降温速度在1000/min以上。适于高度脱水的材料，如种子、花粉球茎或块根等。,B.慢速冷冻法,在冷冻保护剂存在下，以0.1-10/min降温速度从0降到-70，然后投入液氮中。此法适合于大多数植物材料。,C.两步冷冻法,在冷冻保护剂存在下，先以0.5-4/min降温速度从0降到-40，平衡0.5-2h，使细胞达到保护性脱水状态，然后投入液氮中。,D.逐级冷冻法,材料经保护剂在0预处理后，依次经过-10、-15、-23、-40、-7
19、0冰浴处理（每级停留约5min），然后投入液氮中。,（2）玻璃化保存法,将植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使材料和玻璃化保护剂进入玻璃化状态。,玻璃化：是指液体转变为无定形非晶体（玻璃态）的固化过程。,此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的变化，因而不对细胞产生机械损伤和溶液效应。但玻璃化保护剂对材料的毒害性较大。,玻璃化保存的程序：,装载 脱水 液氮冷冻,（装载液：2.0mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖,室温下处理20min）,（玻璃化保护剂：30%GA+15%EG+15%DMSO+0.4mol/L蔗糖+MS-NH4+，0-25处理5-60min）,（3）包埋脱水法超低温保存,材料包埋（海藻酸钙）在含高浓度蔗糖的培养基中预培养脱水和降温投入液氮,易于操作，降温过程不太严格，同时避免了DMSO等保护剂对材料可能造成的伤害。,（4）包埋玻璃化法超低温保存,预培养海藻酸钙包埋玻璃化溶液脱水处理投入液氮中保存,返 回,
