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1、第五章 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,生物科学与技术学院majun,聚合酶链反应,PCR又称体外DNA扩增技术。是利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火-延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速地将皮克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。1g=1000mg=1000000 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。,目的基因,载体,复制子,宿主细胞,扩增,扩增,提取质粒DNA分子
2、,连接,转化,常规的DNA分子克隆扩增法,简单、快速、高效、特异的DNA分子克隆扩增法,ng或pg级的模版,pg级的引物,PCR,电泳分离,回收,高纯度的目的DNA片段,70年代的初期由Dr.H.Klenow发现了较具有实验价值及实用性的E.Coli 的Klenow fragment（部分 DNA Polymerase I）；1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的Taq polymerase，它的特性是耐高温，80年代之后被广泛运用；1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的PCR技术；19
3、87年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。,PCR技术的发现,细胞内DNA复制的过程1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3-OH末端。3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引物的3端，循53方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA双链。4）DNA复制过程为半保留和半不连续复制过程。半保留是指子代的双链DNA仅仅有一条DNA来自亲本。半不连续复制是指其中一条链再复制过程中为
4、了满足53的合成方向，形成不连续的冈崎片段。,第一节 PCR技术的原理,PCR与细胞内DNA复制的区别,PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。依据DNA半保留复制的机理。PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。,Denaturing95C,AnnealingTm-5C,Extension72C,PCR的基本过程,PCR的基本过程,1.变性：将反应体系升温至95左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为模板（待拷贝的 DNA 称为模板）。2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55左右)，5端和3端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域结合。3.延伸：将温度升到75左
5、右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从引物3-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补的DNA链。,模板DNA,引物1,引物2,第一轮PCR,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,第一轮PCR,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,第二轮PCR,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR的扩增效应,理论上，每增加1个循环，双链DNA片段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增加。实际上扩增效应低于指数增加，约为(
6、1+X)n。X约为。一般进行30个左右的循环，特定区域的DNA量可至少增加 106 倍。,PCR产物的积累规律,PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平台效应”。到达平台期所需要的循环次数一般在30次循环之后。,PCR仪,聚合酶链反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及循环次数，是由具有程控的快速升温和快速降温装置的PCR仪控制。,热盖，没热盖的情况下，在PCR反应体系的最后加石蜡油封层。,实验耗材,PCR技术的特点,1、高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平(ug
7、)，这是最主要的特点，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。2、高度的特异性：PCR扩增的特异性由两个引物的序列决定，因此引物设计至关重要。引物与模板DNA特异正确的结合；遵循碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。3、适用样品的广泛性：对样品的要求并不十分严格：可以是DNA，也可以是RNA可以是纯化的，也可以是粗制的可以是新鲜组织，也可以是陈旧组织可以是细胞，也可以是体液4、操作简便、快速：PCR自动化，数小时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。,参与PCR反应体系的因素及其作用,PCR反应体系模
8、板引物Taq DNA聚合酶dNTPMg2+缓冲液,PCR反应条件变性温度变性时间退火温度退火时间延长时间循环次数,（一）模板核酸,1、模板：指能扩增靶DNA片段的核酸2、DNA是直接模板，RNA是间接模板,RNA样品必须先经过逆转录生成cDNA，cDNA作为PCR扩增的模板。这个技术称为逆转录PCR（RT-PCR）。3、常见的扩增对象(含核酸的标本):病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等。病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养细胞系。法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。4、避免有影响扩增反应的物质存在，如核酸酶，能降解DNA、RNA；蛋白酶能降
9、解Taq DNA聚合酶；理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板。5、模板量要合适，一般为102105拷贝。50l PCR反应体系中模板DNA推荐使用量 人基因组DNA：0.1-1 g；大肠杆菌基因组DNA：10-100 ng；DNA：0.5-5 ng,（二）引 物,1、引物的性质和作用引物是人工合成的、能与模板DNA互补结合的脱氧寡核苷酸。分为上游引物和下游引物。引物的序列根据欲扩增的DNA片段两端序列而设计的。引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。特异性：引物只针对DNA的一段特定序列互补结合，因此2条引物与DNA模板特异性结合决定了要扩增的
10、DNA区域。长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA片段的两端，使DNA片段的扩增只限于引物之间的部位。,引物的使用要求,引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1 0.5 mol，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。合适的退火温度比引物本身的Tm低 5，一般在 55 左右。引物的纯化方式有脱盐、BioRP/OPC纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。脱盐纯化：合成的寡核苷酸碱基很多保护基团，同时合成的寡核苷酸还包含一些小分子有机化合物，借助反向硅胶柱可以纯化合成的寡核苷酸，这个过程也叫脱盐。但是此法不能除去提前终止合成的
11、不完整的寡核苷酸杂链，因此只能满足普通PCR的需求。BioRP/OPC纯化：合成的寡核苷酸5-羟基被DMT（二甲氧基三苯甲基）基团保护，而提前终止的寡核苷酸不包含该基团。利用反向树脂和DMT的强亲和力能够成功的把合成好的寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。HPLC纯化：如果合成的寡核苷酸应用于克隆，点突变或基因定量检测，则用HPLC纯化。HPLC为一种纯化树脂，包括阴离子交换树脂或反向树脂等。PAGE纯化：使用交连的聚丙烯酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率（98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。,
12、引物设计的基本要求,1、引物长度要合适，一般为1630个核苷酸，常用20bp左右。引物过短：会影响PCR的特异性；引物过长：需提高相应的退火温度，若超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度，则影响PCR反应产物。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x 109/412=200)。而长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个。2、G+C含量一般占5060，有利于引物与模板的结合。G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。3、ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好随机分布。否则易使引
13、物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。4、引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。5、两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,6、引物与非特异性序列的同源性不能超过70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特异性扩增。7、引物3末端碱基一定要与模板正确配对，引物3端最佳碱基选择是G和C。8、引物的5端可以修饰，如：引入酶切位点、启动子序列、用荧光素、生物素等标记等9、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。,引物设计软件的使用,常用的引物设计软件,Oli
14、go 6（引物评价）*Primer Premier（自动搜索）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*,Preimer Premier 启动界面,Load sequence,Primer Premier 5.0使用介绍-主界面,Primer Premier 5.0使用介绍-基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子
15、偏好,Choose a function,1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）,Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择,First you can desi
16、gn the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,Primer Premier 5.0使用介绍-引物设计界面,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,Primer Premier 5.0使用介绍-引物搜索选项设定,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,Primer Premier 5.0使用介绍-引物搜索结果,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming
17、 and cross dimer,Primer Premier 5.0使用介绍-引物信息界面,引物编辑功能,Edit primer here,Analysis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,Primer Premier 5.0使用介绍-引物编辑界面,Restriction Enzyme Analysis,Melting temperature graph,GC%graph,Stability,作业：设计引物,ATCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG
18、ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAAC
19、GCCGCGTGAGTGATGAAAGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAAT
20、GCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAAGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGAC
21、ATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCAATTTTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTT
22、CTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAATCGTAACAA,（三）Taq DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株(一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90以上几乎无DNA
23、合成，但确有良好的热稳定性。（天然酶）Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。,(一)酶活性与热稳定性,1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg，Taq酶的浓度通常为12.5/l，太多浪费并易导致非特异性扩增。2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温在92.5、95、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。,1）Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对
24、Mg2+浓度非常敏感。2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+浓度，一般反应 中Mg2+的优化浓度至少应比dNTP总浓度高0.51.0 mmol/L。4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高5060%。,(二)离子依赖性,1）TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53外切酶活性，而无3 5外切活性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.,(三)忠实性,(四)T
25、aq酶的最适温度,7580每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒，70延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为22个核苷酸/秒。最适温度75左右。,（四）原料,（五）Mg2+,原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度为 20200mol/L。,Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。浓度为0.52.5mmol/L。太少：酶活性明显降低；太多：导致非特异性扩增。,反应缓冲液：常用10mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.38.8为Taq 酶最适pH值。,（六）缓冲液,（七）反应温度和时间,1、变性：95，30”1，双链DNA变成单链。2、退火：55，30”1，引物与模板互补结合。退火温度对特异性
26、影响很大。退火温度=Tm值-(510)，Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T）3、延伸：7275，1 2，Taq 酶催化dNTP，从引物3-OH端开始，与模板互补，合成一条新的DNA链。4、循环次数：主要取决于模板DNA的起始浓度，合适的循环数为25 30次。循环数太少：产物量不多循环数太多：非特异性扩增会增加，出现平台效应,小于20bp片段,举例：PCR反应体系,5扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双蒸水至 50ul,PCR常见问题,1.无扩
27、增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物,现象：对照组有条带，而样品则无；,2.非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,对策,重新设计引物适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低Mg2+浓度减少循环次数,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,3.拖尾,现象：产物在凝胶上呈拖尾状态。,模板不纯降解退
28、火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,纯化模板改变条件适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和Mg2+的浓度减少循环次数,原因,对策,4.假阳性,原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,PCR实验注意事项,由于PCR的灵敏性极高，故微量的样品污染便可导致假阳性结果的出现。所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染。采取的措施：1）隔离不同的操作区2）采用一次
29、性用具3）严格按无菌操作原则进行4）并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。除实验样品外，应设几种实验对照：1）阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR反应；阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本。2）阴性对照：无核酸模板参与的PCR反应；在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。,PCR扩增产物的电泳分析,琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶
30、解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳缓冲液,常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解,核酸电泳的指示剂,指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰在碱性液
31、体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，其迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。,核酸电泳的染色剂,溴化乙锭（ethidium bromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5g/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。溴
32、化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。GoldView是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生
33、很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。,示例电泳结果,第二节 常用几种PCR反应,一、逆转录 PCR RT-PCR,原理：先在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。,巢式PCR（nested PCR），利用两套PCR引物对（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物再在内引物的存在下进行第二轮扩增。,二、巢式PCR（已知DNA序列）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物
34、都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列的模板量，并且提高了特异性。,巢式PCR不受平台效应的限制，比单一的一对引物的PCR扩增灵敏度特异性高1000倍。,延伸的技术：1、热巢式PCR：第二对引物放射性标记，灵敏度又提高一个级别。2、半巢式PCR：第二对引物中的一条为第一条引物的一条，另外一条为靶序列中的互补序列。,巢式PCR,不对称PCR 用不等量的一对引物扩增后产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为501001。在PCR反应的最初1015个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(
35、高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。主要为测序制备ss-DNA，为了制备探针。,三、不对称 PCR（已知DNA序列）,高浓度引物,低浓度引物,不对称PCR,四、实时 PCR,实时PCR（real-time polymerase chain reaction）又称荧光定量PCR。是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR仪是
36、一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCR，得到广泛应用。荧光定量PCR标记方法：特异性探针：如Taqman法嵌入染料：如SYBR Green I法（内参和外参）,PCR引物,实时PCR技术原理-SYBR Green,SYBR Green,实时PCR技术原理-Taqman探针,PCR引物,报告基团,淬灭基团,报告基团,淬灭基团,Taqman探针,完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转
37、移），无荧光产生。,无荧光信号产生,能量,1、变性(95C),实时PCR技术的过程,2、退火(60C),DNA聚合酶,3、延伸(72C),?,53外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来,荧光定量PCR和与普通PCR的区别,普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。,起始DNA量反映样本中的DNA初始量，更具有实际意义。终点DNA量是经过PCR扩增后的量，存在部分的失真性。起始
38、定量重现性好，定量准确，能够反映样本中初始DNA或初始目的基因的量。终点定量重复性差，定量不准确，不能够反映样本中初始DNA或初始目的基因的量。,起点定量与终点定量,由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异。,Main Principle of realtime PCR,DNA量+荧光基团,激发光,发散光,读取信号,Curve of Realtime PCR,荧光信号阈值（threshold）：也叫基线，前15个循环信号作为荧光本底信号，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值相同。通常荧光阈值的缺省设置是3-15个循环。threshold可以手动设置，原则是大于样本的荧光背景
39、值和阴性对照的荧光最大值，同时要尽量选择进入指数期初期阶段。真正的信号是荧光信号超过threshold的值。,平台期,对数期,基线期,每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值,SYBR Green 法,SYBR Green 熔解曲线分析,SYBR Green法优缺点,优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜,TaqMan探针法,TaqMan法优缺点,绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同
40、组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究,Two method of Quantitative,Absolute quantification,模版DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样本中目的基因的量。,Relative quantification,相对定量通过内标定量内标（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等内标基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,相对定量分析方法
41、-Ct,1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：CT(test)=CT(target,test)-CT(ref,test)CT(calibrator)=CT(target,calibrator)-CT(ref,calibrator)2、用校准样本的CT值归一试验样本的CT值：CT=CT(test)CT(calibrator)3、计算表达水平比率：2 CT=表达量的比值,前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏差在5以内。,五、降落 PCR（已知DNA序列）,降落PCR（touchdown PCR），一种PCR技术，主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行
42、，例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低，但退火温度过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化，但费时费力。降落PCR在较高的温度下扩增，此时虽然扩增效率低，但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低，非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势，因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制，从而大幅提高PCR的特异性和效率。例：一对没有简并的引物的Tm值为62。则：从6550（每2cycles降退火温度1），再在50退火温度下做15个循环。,六、RACE（获取cDNA末端序列）,RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是
43、通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。使用此方法的要求是必须知道至少2328个核苷酸序列信息，以此来设计5末端和3末端RACE反应的基因特异性引物（GSPs）。分为3RACE 和5RACE,GSPs引物的设计,基因特异性引物（GSPs）应该是：2328nt5070%GCTm值65度，Tm值70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5和3RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2)。由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。,3RACE原理示意图,降解RNA,合成cDNA,5RACE原理示意图,NCBI
44、基因、核苷酸序列搜索,网站地址：,1 gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 61 cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 121 aactccggga aaccgggcta ataccggatg cttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa 181 aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta 241 ac
45、ggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac 301 tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa 361 agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt 421 tagggaagaa caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc 481 cacggctaac tacgtgccag
46、cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat 541 tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca 601 accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca 661 cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg 721 gtatgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcg
47、a acaggattag ataccctggt 781 agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca 841 gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat 901 tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 961 ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggc
48、aga 1021 gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1081 aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc 1141 cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1201 gctacacacg tgctacaatg ggcagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat1261 cccacaaa
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