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1、基 因 工 程 载体,南 京 农 业 大 学 陈 溥 言,概 述,基因工程是利用酶学方法将不同来源的DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插入到不同目的的基因工程载体中，进行扩增和表达，研究基因结构和功能，基因和蛋白质关系的一种分子生物学技术。,载体,基因工程的十分重要的工具。载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可送入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA重组并共同扩增。,目前的载体主要有：1,质粒（Plasmid）载体2,入噬菌体3,柯斯质粒（Cosmid）4,M13噬菌体5,杂交质粒6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle）。7,细菌人工染色
2、体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya，1992 BAC)8,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC)9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC,loannon，1994）、10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome，Farr，1991）11,人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome，Harrington,1997）12,植物人工染色体(PAC
3、),质 粒 载 体（Plasmid）一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类DNA。酵母的杀伤质粒（Killer Plasmid）是例外,它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在 线状质粒。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型。,质粒载体,质粒DNA的一般特点：质粒DNA可在宿主菌中自主复制，又是细菌复制非必须的。占总的基因组的13%。所有原核生物都有质粒。赋于细菌一种表型，是菌株特性不是菌种特性。隐蔽质粒(Crypt
4、ic plasmid)。质粒都是双链闭环DNA复制子，酵母的杀伤质粒例外(RNA)。,质粒的一般生物学性质,1969年Rownd提出严紧型复制控制的质粒和松驰型控制的质粒。主要指在标准的培养基生长条件下，每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数多少划分的。严紧型质粒，一般分子量较高；每个寄主细胞中仅含1060个拷贝的质粒；松驰型质粒,每个细菌中所含的质粒DNA的拷贝数高,一种质粒究竟属于严紧型还是松驰型并不是绝对的。往往与寄主状况有关。质粒的复制不仅受自身的制约，而且还受寄主菌的控制。氯霉素是蛋白质合成的抑制剂，一般在细菌生长的对数生长期后期(细菌达1109细胞/mL)，加入氯霉素或壮观霉素，细菌染
5、色体和严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒经过1012小时，每个细胞中可多达几百个，甚至几千个质粒。每个细胞中可达50%以上DNA是质粒DNA。,严紧型(Stringent plasmid)和松驰型(relaxed plasmid)质粒,PUC质粒都属松驰型质粒。PACYC184等质粒属严紧型质粒。根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。,2.质粒的不相容性(incompatibility),利用同一复制系统不同质粒不能稳定的和平共处的生存，称为质粒的不相容性，有时又称不亲和性，是指在没有选择压
6、力情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定地共存现象。在细菌增殖过程中，其中一种质粒必然会丢失。分子克隆技术正基于质粒的不相容性质，在只带有一种质粒的细菌中，提取单一的DNA。,3.质粒的转移性,革兰氏阴性细菌的质粒分为接合型质粒(Conjugative plasmid)，又叫自我转移质粒。它们既具有自我复制遗传信息，又具有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。接合型质粒多属于严紧型质粒。非接合型质粒(non-conjugative plasmid)也叫不能自我转移的质粒。因为它们仅仅带有自主复制的遗传信息。非接合型质粒多属于松驰型质粒。,1）质粒的类型,非接合型质粒的寄
7、主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。,带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以迁移但属于非接合型质粒。,2）F 因子,F因子是最有代表性的接合型质粒，又称致育因子(fertility fac
8、tor)或性质粒(Sex plasmid)。它在寄主细胞中有三种存在方式：独立于染色体之外，闭环双链DNA形式存在。这种细胞称F+细胞。独立于染色体之外，闭环双链DNA形式存在，但其DNA上还携带有寄主菌染色体基因或DNA区段。这种细胞称之为F-细胞。以线性DNA形式，从不同位点整合到寄主菌染色体上，这种细胞称为Hfr细胞(高频重组细胞)。,F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+经性须进入F-细胞。F-细胞则变为F+细胞。F因子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新
9、变为F+或F-细胞。基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度考虑,人工质粒要素,1质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题）。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质粒大于15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大，拷贝数越低。2质粒应易于转化。3质粒应有较多的拷贝数。4选择标记。5质粒DNA可插入结合较大的外源DNA,。,大肠杆菌质粒分子的结构示意图,环形染色体DNA,环形质粒分子,大肠杆菌细胞,抗菌素抗性基因,控制质粒DNA转移的基因,质粒DNA,质粒主要包括几个组成部分,复制子（reilcator）复制起始位点(replication origin site)多克隆位点（Polylink）(
10、MCS)辅助序列(COS位点等)选择标记(LacZ,抗性等),pUC 18 和pUC 19质粒图谱,质粒主要包括几个组成部分：一、复制子（reilcator）也就是基础复制子（basic replicon），具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位。一般约2kb，含一个复制起始部位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复制的基因信息。,复制起始位点(replication origin site)是富 含A,T区,双链DNA在此 解鏈出现复制叉.紧靠富 A,T区的侧面富G,C区,组成回文结构,是参与复制相关因子识别和结合位点.,具备有多克隆位点（Polylink）(MCS)有数种限制性内切酶
11、单一识别位点。便于插入外源DNA片段，易组建重组质粒而不影响质粒复制功能,有多用途的辅助序列如加入不同启动子序列，用于生产单链DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片段等等。,质粒载体的选择标记：外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需要利用质粒载体的可选择标记。,质粒载体的选择标记,最常用，主要有：四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan)、新霉素(Neo)等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成Ampr，反之则写成Amps。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素
12、抗性基因，这样筛选质粒载体更可靠。外源DNA片段插入钝化了一个抗性基因，保留了另一个抗性基因。插入失活型载体，就是将外源DNA片段插入到会导致选择性基因(Ampr，Tetr等)失活的位点。如PACYC184质粒的EcoRI上插入外源DNA片段，会导致氯霉素抗生基因失活(Cms)。也有例外，如Villa-Komaroff等1978年发现鼠胰岛素cDNA片段插入PstI切点，并未使Ampr基因失活。,抗生素抗性基因选择标记,常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有：四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成AmP
13、r，反之则写成AmPs，。带有抗药性质粒称为R质粒。一个质粒载体通常有二种抗生素抗性基因,新的质粒还带有下列标记基因，使于筛选重组体：HALuaferaseGFP便于检测的多肽,原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸(fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。,丢失四环素抗性标记的正选择体系,四环素抗菌机理是抑制细菌蛋白质合成，使细菌停止生长，但菌不死亡。环丝氨酸是氨基酸的类似物，在细菌的生长过程中，如加入环丝氨酸，则会参入到细菌新合成的蛋白质多肽链，使细菌死亡
14、。所以在含有四环素培养基上，环丝氨酸只杀死Tetr 细菌。对停止生长的 Tets 菌则无致死作用。若经过环丝氨酸法多次重复处理 Tets 菌会富集，产量上可高出数倍，便于筛选重组子。,环丝氨酸富集法筛Tets重组子,环丝氨酸富集法示意图,AmprTets转化子(带插入片段),转化混合物,氨苄青霉素选择,四环素环丝氨酸选择,通常用互补现象的检查。很多质粒载体DNA都有一段(来自大肠杆菌DNA)含半乳糖苷酶基因(LacZ)的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。并在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，并不破坏阅读框。而宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完
15、整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了LacZ的阅读框，不能使X-gal变蓝，而产生白色菌落。这种LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体(宿主菌)与带有完整的近操纵基因片段的-半乳糖苷酶阴性的突变体(质粒载体)之间实现互补，这种互补现象称为互补。这样通过明显的颜色变化，挑选重组子则变得简单易行。往往在这过程中还要加入IPTG(异丙基硫化-D-半乳糖苷)作为酶反应催化剂。,4.显色法筛选重组子,质粒DNA有一段（来自大肠杆菌DNA）含半乳糖苷酶基因（Lac
16、Z）的调控序列和该酶基因氨基端146个氨基酸编码信息。在这个编码区中加入一个多克隆酶切位点，不破坏阅读框。宿主菌有编码半乳糖苷酶C端部分序列，宿主菌和质粒编码片段各自基因都不完整，都没有酶活性，当质粒转化入宿主菌后就会产生具有酶活性的蛋白质，加入生色底物Xgal后会形成蓝色菌落。而插入DNA的重组子则破坏了Lac Z的阅读框，不能使Xgal变兰，而产生白色菌落。这种突变体（宿主菌）与质粒载体之间互补现象称为互补。入IPTG作为酶反应催化剂。,通过颜色变化筛选重组子。通常用互补现象的检查,互补原理:,质粒的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的氨基端宿主菌的Lac Z仅编码-半乳糖苷酶的羧基端,均无活性
17、,各自编码的肽链可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白。,5-嗅-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷（X-gal),蓝色产物,-半乳糖苷酶异丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG),蓝-白斑实验,构建的质粒人工载体，应用最广的是PBR322，分子量为2.6106，含46332bp。含有选择标记抗氨苄青霉素（Apr）基因来自天然质粒RSF2124和抗四环素（Ter）基因来自PSC101质粒。复制子部分来自PMB9（一类Co1E1质粒）。多克隆限制性内节切酶位点有9个,在PBR322的基础上已构建出第二代，第三代质粒载体衍生物。PUC系列，Pbluescript质粒，体积更小，具有更多的单一限制性内切酶位点，其拷贝
18、数也比PBR322多1020倍。可获得更多的DNA产量。,质粒的消除有的质粒在自然条件下可以从宿主菌中消失。也可以在培养细菌时加入适当的理化因素使质粒消除（curing）。质粒的消除剂有：吖啶橙，溴化乙锭，利福平，SDS，紫外线，高温等。,不同载体的用途不尽相同：,1）克隆、扩增外源基因(片段大小)：质粒用于常规DNA克隆。COSmid和噬菌体用于染色体，大的DNA片段克隆。2）外源DNA或cDNA在载体上进行改造、缺失、重组一般用质粒。3）序列分析：dsDNA或ssDNA测序，用质粒或M13以及一些新型质粒。4）制备探针：单链DNA或RNA利用质粒，制各单链DNA探针利用M13。5）表达原核
19、基因的载体：质粒，入噬菌体(表呈技术),6）表达真核基因载体(包括病毒疫苗研制)：质粒、酵母、病毒7）转移载体：将外源基因转入哺乳动物细胞中，建立稳定表达基因的细胞株，常用质粒和病毒载体。8）PCR产物克隆载体：T载体、Teasy载体、PCR等。9）DNA疫苗载体10）研究基因结构功能的载体，如无启动子载体。,载体如何选择：1根据插入片段大小，及酶切位点。2重组体的目的、作用（文库、表达、基因调控、探针、突变）。3筛选方便（探针、免疫学方法、抗性、显色）。4便于提纯（加入His、生物学、牛血清血蛋白BSA）。不同载体用途不尽相同,一、克隆、扩增外源基因（片段大小）质粒用于常规DNA克隆。COS
20、mid和入噬菌体,细菌人工染色体.酵母人工染色体,用于染色体，大的DNA片段克隆。,二、外源DNA或CDNA在载体上进行改造、缺失、重组一般用质粒。三、序列分析dsDNA或ssDNA测序，用质粒或M13以及一些新型质粒。四、制备探针 单链DNA或RNA利用质粒，制各单链DNA探针利用M13。五、表达原核基因的载体质粒，入噬菌体（表呈技术）,六、表达真核基因载体（包括病毒疫苗研制）质粒、酶母、病毒七、转移载体将外源基因转入哺乳动物细胞中，建立稳定表达基因的细胞株。常用质粒和病毒载体,八、PCR产物克隆载体T载体、Teagy载体、PCR等。九、DNA疫苗载体。十、研究基因结构功能的载体如无启动子载
21、体,iRNA,干扰试验 核酶 嵌合病毒技术 反向遗传操作系统（Reverse Genetics)寻找表达差异基因的常用方法SSH(Suppression Substractive Hybridization SSH)抑制性差减杂交技术,DD-PCR(Differential Display PCR)差异显示PCR,RDA(Representational Differential Analysis),Array(基因微阵列技术)，人工染色体 假病毒技术,1976年提出统一命名规则：质粒用小写p代表，后二个大写字母为发现者或实验室，后面是编号。如：pBR322、pUC18、pUC19等。,质粒的命名,（3）注意事项,宿主菌取出时应注意菌株名及编号。检查宿主菌，应无质粒污染，无抗菌素抗性。整个操作过程应保持无菌状态。LB培养液中不能有抗生素。不同受体菌，培养要求不同。如 K802株，OD550=0.5 最好，而X1776株，OD550=0.20.3最好。质粒的DNA比较小，有助于其转于宿主细胞中的效率。转化效率与质粒大小成反比。而质粒大于15kb时，转化率成为限制因素。同时质粒大，复制的拷贝数低。,
