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1、微生物学实验技术,一株产中性蛋白酶芽孢细菌的选育研究,山东农业大学生命科学学院微生物学系2012.8,实验内容,一、产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选二、产中性蛋白酶芽孢细菌的诱变育种三、产中性蛋白酶芽孢细菌的分类鉴定四、产酶菌株生长曲线的测定五、菌种保藏技术,实验要求,一、每个实验相对独立，都要提交实验 报告；二、课程中间进行三次测验考核，不再 进行期末考试；三、每8人一组，独立完成实验。,实验一 产中性蛋白酶芽孢细菌的筛选,一、目的意义二、材料方法三、数据结果四、讨论分析五、参考文献,一、目的意义,1、筛选获得一株高产中性蛋白酶的芽孢细菌菌株。2、学习掌握从样品采集到菌种保藏的技术流程。,关键技术
2、:,综合实验方案设计实验准备样品采集酪蛋白平板水解圈法初筛无菌操作,二、材料方法,技术路线,样品采集：选用豆豉等富含蛋白质的自然样品进行筛选。富集培养：以酪蛋白为唯一碳源富集培养目标菌株。预处理：80水浴10分钟 初筛：水解圈法 复筛：分光光度计法,第一次实验：,讨论并设计实验方案；实验材料准备：培养基、无菌水等；样品预处理（5g豆豉，加入45ml无菌水，80水浴10分钟处理）系列稀释涂平板；37倒置培养48h；,酪蛋白筛选固体培养基酪蛋白：5.0g；酵母膏：2.0 g；琼 脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH:7.0。,第二次实验：,从第一次实验的平板上，观察选择产生水解圈的菌落，制片镜
3、检观察；选择水解圈最大的、产芽孢的菌落进行下一步操作；将水解圈最大的芽孢细菌菌落作为目标物，在LB平板上进行划线分离；37倒置培养24h；,LB分离纯化固体培养基蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；琼 脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH到 7.0。,第三次实验：,挑取生长饱满的单菌落转接入LB试管斜面，每个分离物转接5支试管。37培养24h，保藏备用；讨论下一步实验方案（紫外线诱变育种）并准备实验材料；,LB斜面保藏固体培养基（同纯化培养基）蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；琼 脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH到 7.0。,三、数
4、据结果,初筛依据：水解圈直径（D2）：菌落直径（D1）D2/D1=？复筛依据Folin-酚法 测定中性蛋白酶活性,四、讨论分析,样品采集预处理富集培养初筛复筛评价体系,五、参考文献（举例）,1 孙妍等，产蛋白酶和纤维素酶纳豆芽孢杆菌益生菌株的 筛选及其生长特性研究，东北农业大学 学报，第42卷 第3期，42（3）：3942。2 蔡婉玲等，蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种，生物 技术，2011年21（1）。3 宋园亮等，元阳豆豉中高产蛋白酶乳酸菌的筛选及其产 酶条件的研究，中国微生态学杂志，2011年1月第23卷 第1期。4 肖峰等，一株产中性蛋白酶海洋细菌的筛选与初步鉴 定，食品与药品，2011年第13卷第03期5,
