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1、实验八,质粒DNA的小量制备,一般操作步骤：,培养细菌使质粒扩增,收集和裂解细菌,分离质粒DNA,碱变性法煮沸法去污剂法有机溶剂法,一、实验目的,掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理熟悉碱裂解法提取质粒DNA的方法,分离质粒DNA需要去除的：,大肠杆菌染色体DNA蛋白质RNA,二、实验原理,碱变性法抽提质粒的原理,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。,在EDTA、（溶菌酶）和表面活性剂的存在下，经碱处理溶菌，同时在pH高达12.012.6 的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的
2、两条互补链不会完全分离。,当以pH4.8的KAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA、不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,降解的小分子RNA可通过Rnase A处理去除未除净的蛋白质可通过苯酚/氯仿抽提除去。,三、实验材料,LB液体培养基、氨苄青霉素 溶液、RNase A、预冷无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液DH5-pCR2.1-Rv1791,提质粒用溶液、,溶液（细菌重悬液）：50mM Tris-HCl 10mM EDTA pH 7.5,溶液(细菌裂解
3、液）：0.4M NaOH 2%SDS溶液:1.32M KAc pH 4.8(用醋酸调）,四、实验具体步骤,1.挑取转化平板上的单菌落至2ml LB培养液中（含Amp 100g/ml），37，250rpm，培养过夜。2.取1.5ml培养物至指形管中，12,000rpm，30s。3.吸去上清，使沉淀尽可能干燥。,4.将细菌沉淀悬浮于200l预冷的溶液中，剧烈振荡。5.加200l溶液（新鲜配制），盖紧管口，快速颠倒5次以混匀内容物。冰上放置。6.加入200l溶液（冰上预冷），盖紧管口，温和振荡，冰上放置3-5min。,7.4，12,000rpm，5min，将上清转移至另一离心管中。8.加入等体积酚/
4、氯仿（1:1），振荡混匀，4，12,000rpm，2min，将上清转移到另一离心管中。(此步也可不做)9.加入2倍体积的无水乙醇，室温静置2min。,10.4，12,000rpm，5min。11.弃上清，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。12.用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，弃上清，吸干，在空气中干燥10min。13.加入30l TE缓冲液（含20g/ml RNase A，不含DNA酶），使DNA完全溶解。,14.37，保温30min，消化RNA，取出置-20保存。,五.实验结果,通过凝胶电泳和紫外分光法检测抽提的质粒浓度及纯度。,六、思考题,溶液I、溶液II和溶液III在提取质粒的过程中的作用分别是什么？,
