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1、实验六、细胞凋亡的诱导及观察,2002年10月7日，瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔奖评审委员会将2002年诺贝尔生理学或医学奖授予了悉尼布雷内、罗伯特霍维茨和约翰苏尔斯顿三位科学家，以表彰他们在“细胞程序性死亡”这一领域中的开创性工作。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡，而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。,实验目的,1.了解细胞凋亡的原理2.学习离体诱导细胞凋亡的方法2.掌握利用普通显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞形态的方法,一、细胞死亡（cell death）,定义：细胞生命现象不可逆的停止，分为两种形式，即坏死性死亡和程序性死亡。,1.坏死性死亡（necrosis）,定
2、义：细胞外部的化学、物理或者生物的因素的侵袭而造成的细胞崩溃和裂解，是被动的死亡。,2.程序性死亡（programmed cell death,PCD）,定义：细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是细胞接受指令后进行的主动性死亡，涉及一系列基因的激活、表达和调控。受内在遗传机制的控制主动结束生命的过程。程序性死亡主要包括细胞凋亡（apoptosis）和细胞自噬（autophage)，,2.1 细胞凋亡（apoptosis）,定义：是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡过程.凋亡细胞将被邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化,2.2 细胞凋亡诱导因素,内源性因素
3、；内源性的因素包括细胞凋亡诱发机制（如as配体、肿瘤坏死因子等）的激活和抑制机制（生长因子、激素、受体因子等增殖性因子）的失活。外源性的因素；外源性的因素包括放射线、热休克等物理性因素，药物、毒物等化学性因素以及病毒、细菌等生物学因素。,2.3 细胞凋亡的生物学特征,形态学特征生物化学特征 DNA片段化 大分子的合成 tTG（组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。,形态学特征,细胞变圆、胞质皱缩，细胞体积减小，染色质凝聚，核碎裂成为染色质块（核碎片）。整个细胞通过发芽、起泡等方式产生一些球形突起，并在基部脱落形成大小不等的、内含胞质、细胞器和核碎片的凋亡小体（apoptotic body）
4、。,凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成:核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体凋亡小体逐渐为邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化。,细胞凋亡过程的3个阶段,细胞的两种死亡方式及比较,细胞凋亡的形态学检测,1 光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见
5、凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst 33342;HO,Hoechst 33258;DAPI；吖啶橙。3 电子显微镜观察,DAPI,4，6-联脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole)可以穿透活细胞膜，对活细胞无毒副作用 与双链DNA结合产生比DAPI自身强20多倍的荧光与单链DNA结合后，荧光不增强ex340nm;em488nm(nur DAPI)
6、ex364nm;em454nm(DAPI-DNA-complex)（蓝光）优点：结合力强，荧光强且稳定缺点：自身有荧光，背景高。致癌,Nuclear morphological changes of HeLa cells in apoptosis process by using DAPI,Hoechst,Hoechst是一种水溶性双苯咪唑类化合物，可以穿透活细胞膜，Hoechst 33342比Hoechst 33258更易穿透活细胞膜，对活细胞的毒性较低 与DNA结合后荧光明显增强ex346nm;em460nm(33258)ex350nm;em461nm(Hoechst-DNA-comple
7、x)（蓝光）在凋亡细胞中，细胞膜对Hoechst 33258的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，染色呈强蓝色荧光,优点：结合力强，荧光强于DAPI，缺点：自身有荧光，背景高。稳定性比DAPI差，致癌,结 果,正常细胞核,有致密浓染的 凋亡细胞核,吖啶橙,3,6-Bis(dimethylamino)acridine hydrochloride吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。细胞核因含DNA呈绿色，细胞质及核仁因含RNA呈红色；ex495nm;em526nm in TE buffer pH 8.0 em52
8、6nm with DNA,em650nm with DNA(enhanced fluorescence with DNA）,优点：结合力强，稳定缺点：自身有荧光，背景高。,电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块。,T细胞杂交瘤细胞(扫描电镜),内源性核酸内切酶基因的活化和表达，导致凋亡细胞的染色质DNA的有控裂解，得到的DNA片段的长度为180-200bp的倍数。,生化特征：DNA梯状条带,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色
9、素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker（自赵允、翟中和）,最简便可靠的方法,2.4 细胞凋亡的意义,1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对细胞凋亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。如：健康的成人体内，在骨髓和肠中，每小时约有10亿个细胞凋亡。,2.细胞凋亡在形态建成中起到重要作用（如手指和脚趾的发育），或者对于不再需要的构造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。,3.细胞凋亡还能够调节细胞的数量和质量。,细胞凋亡对发育中 神经细胞数量的调节,4.细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识,实验六、细胞凋亡的观察,原理：HeLa细胞经放线菌素D诱导后
10、，可以产生不同程度的细胞凋亡，利用荧光染色，可以观察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈颗粒团状分布，颜色较正常细胞致密且浓染。,材料及设备：,HeLa贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素D（Actinomycin D）、吖啶橙荧光染料、卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘油荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小烧杯等。,实验步骤,1.诱导：向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放线菌素D溶液1015l（终浓度0.50.75ug/ml），继续培养18 h左右；2.细胞收集和洗涤：将细胞悬液平均转移到4个1.5毫升的EP管中，用1ml生理
11、盐水清洗细胞,去掉生理盐水,将瓶壁上剩余细胞用1ml 0.25%的胰酶消化3min后，将细胞悬液加入培养皿,吹打生长面,平均合并至4个EP管中。以2000rpm离心 6-8min，去上清；,3.细胞预固定和固定：加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞，使细胞分散，加入0.1毫升卡诺氏固定液，混匀；离心，去上清（保留0.1毫升生理盐水）；加入固定液至1毫升，小心悬浮细胞，室温下固定处理10min，离心，去上清，加入0.1毫升固定液，小心充分混匀细胞；,4.制片（空气干燥法）,取一滴细胞悬液，滴于倾斜放置的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散，自然干燥。,cover slip,5.染色：滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上，铺开染液，置标本于培养皿中，室温下黑暗环境中染色10min，自来水小心冲洗,自然晾干（避光）。6.封片及观察：在载玻片（slide）上滴一滴10%的甘油，用镊子小心将贴有细胞的盖玻片盖在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡，及时于荧光显微镜下观察。,注意事项,1.固定和染色时间的控制2.离心时，注意平衡3.弃上清时，避免将细胞沉淀弃除4.染色后，及时观察4.吖啶橙染液有毒，勿接触皮肤5.眼睛勿长时间直视荧光显微镜的激发光源和标本发射光6.癌细胞器具均需要消毒后再清洗,
