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1、酵母核糖核酸的分离及组分鉴定,生物化学实验,一、实验目的,1.掌握RNA的提取方法2.学会使用地衣酚法测定RNA的含量3.熟悉和掌握离心机的使用方法,二、实验原理,由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%
2、。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生
3、白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀(NH4)3PO412MoO3。,二、实验原理,三、仪器、原料和试剂,仪器：试管；烧杯：100mL；移液管：0.2mL(1)、2.0mL(2)、1mL(2)；量筒：10 mL、50mL各一个；滴管；电磁炉；离心机；布氏漏斗。原料：干酵母粉,低速离心机,三、仪器、原料和试剂,试剂：（1）0.2%氢氧化钠溶液；（2）10%硫酸；（3）0.1mol/L硝酸银溶液（5
4、%硝酸银溶液）；（4）1mol/L浓氨水；（5）酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；（6）地衣酚试剂：100mg地衣酚，溶于100ml浓盐酸中，再加100mgFeCl36H2O或等量的CuO；（7）定P试剂：a.17%硫酸：17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入83ml水中 b.2.5%钼酸铵溶液：2.5g钼酸铵溶于100ml水中 c.10%Vc（抗坏血酸）溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水中。棕色瓶储存。溶液程淡黄色尚可使用。呈深黄色甚至棕色即失效。临用时将上述三种溶液与水按如下比例混合，a：b：c：水=1：1：1：2,四、实验步骤,1、酵母RNA的提取（1）称8g干酵母粉悬浮
5、于40mL 0.2%NaOH 溶液的100mL烧杯中 沸水浴加热30分钟，不断搅拌。（2）冷却后，4000r/min离心8分钟，将上清液慢慢倾入20mL酸性乙醇的烧杯中，边倒边搅。而后静置10分钟，待RNA完全沉淀，4000r/min离心8min。（3）弃去上清，沉淀为RNA粗制品。2、水解 RNA粗制品转移至三角瓶中，加10mL10%硫酸，盖上漏斗，沸水浴10分钟，过滤，弃去滤渣，滤液备用。,3、RNA组分鉴定（1）嘌呤碱：取一支试管，加入20滴5%硝酸银溶液，逐滴加入浓氨水至沉淀消失，然后加入20滴水解液，静止，观察白色絮状沉淀生成即为嘌呤碱银化合物沉淀。（2）核糖：取一支试管，加入20滴水解液，然后加入20滴地衣酚试剂，在沸水浴中加热5分钟，观察有没有变绿。（3）磷酸：取一支试管，加入20滴水解液，然后加入20滴定P试剂，在沸水浴中加热5分钟，观察有没有变蓝。,五、结果与讨论,六、注意事项,稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。离心时要配平。水浴时要搅拌，注意安全。,七、思考题,1.DNA对本法测定RNA含量是否有影响?若有影响，如何消除?2.你能知道CuO或FeCl36H2O在地衣酚法测定RNA中的作用吗?,
