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1、一、实验目的1.初步掌握冻存与复苏的原理及其操作过程2.继续强化细胞无菌操作理念,实验十一、细胞的冻存与复苏,二、实验材料与用品,（一）材料：Hela细胞（二）试剂 培养液：1640培养液+15%小牛血清；胰蛋白酶消化液：0.25%；冻存液、液氮,三、实验原理,细胞冻存的原理：当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,低温保护剂的应用的原理,1、在细胞冻存时加入温保护剂，
2、能大大提高冻存效率2、常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。常用细胞冷冻保存液 10DMSO 20血清基础培养液10甘油 20血清基础培养液,细胞复苏原理及要点,当细胞冷到-5至零度时，可以产生以下变化：细胞器脱水，在细胞内形成冰晶，对细胞器有损伤，复苏时应尽快通过该温度。细胞对冷冻保护剂特别敏感，解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶。,一、细胞冻存方法,1.预先配制冻存液：含10-30%血清
3、培养基，10%DMSO。2.取对数生长期细胞，胰酶消化后，加全培养基终止消化，1000rpm离心收集细胞，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4.冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟-80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存,四、实验步骤,冷冻保存要点DMSO液用培养液配好冰上预冷，避免因临时配制产热而伤害细胞。冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：1106-5106/ml。,液氮罐,细胞保存条件,二、细胞复苏方法,1.从液氮中取出冷冻管，迅速
4、投入3738(或者42)水浴中，使其融化（1分钟左右）。2.将冻存的细胞液转移至新10ml离心管中，加入5ml培养液。3.低速离心，1000rpm，10分钟。4.去上清，加新鲜培养液3ml。5.将刚复苏的细胞转移至培养瓶中，C02培养箱，37 培养。,复苏要点,快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）,注意事项,1、操作前，提前将操作间和超净工作台内紫外灯打开，消毒杀菌30 分钟。2、进操作间前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。3、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。4、手不能在开盖的消毒物品上方活动。5、吸溶液的吸管等不能混用。6、冻存复苏时，操作要带手套，防止冻伤。7、应在无菌条件下操作，注意操作要领，避免污染细胞。,谢谢各位认真听讲！,
