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1、实验六 细胞骨架的观察,一、考马斯亮兰R250染色法,【实验目的】掌握用考马斯亮蓝R250(Coomassie blue R250)染色法观察植物细胞骨架的方法。,【实验原理】,细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系。其概念具有狭义和广义之分:狭义的细胞骨架是指细胞质骨架包括微丝、微管和中间纤维;广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接,贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。,【实验原理】,细胞骨架(Cytoskeleton)组成:主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。微管主要分布在核周围,呈放射状向四周扩散,微
2、丝主要分布于细胞质膜的内侧,而中间纤维则分布在整个细胞中。细胞骨架作用:具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。细胞骨架的研究方法:考马斯亮兰R250染色法、荧光素标记的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。,考马斯亮兰R250染色法的原理:考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进行染色。细胞骨架有一个特性,即用非离子去垢剂(如Triton X-100)处理时,可以保持非溶解状态。当用这类试剂处理细胞时,细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来,只留下细胞骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进行特异性染色,但当其它蛋白成分被抽提后,就能
3、清晰地显示微丝束的形态。,Triton X-100,SDS,实验器材、材料和试剂,光学显微镜;烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片;新鲜洋葱;,6mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)、M缓冲液、1%Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。,3%戊二醛用PBS配制,实验步骤,1、撕取洋葱鳞茎内表皮(约1平方厘米)置于35ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯1);对照无PBS处理;2、用35ml 1%Triton X-100处理20 min(烧杯2);对照无1%Triton X-100的M缓冲液处理20min;3、吸去Triton X-100,用M缓冲液35ml洗2次,每次5 min(烧杯3);对照无M缓冲液处理;4、35ml 3%戊二醛固定20 min(烧杯4);5、pH6.8磷酸缓冲液35ml洗2次,每次5 min,滤纸吸去残液(烧杯1);6、35ml 0.2%考马斯亮蓝R250染色15和30分钟,然后用蒸馏水小心冲洗12次(烧杯5);做染色时间的影响;7、将表皮铺放在载玻片上,加盖玻片,在高倍显微镜或者油镜下进行观察。,细 胞 骨 架,洋葱表皮细胞骨架,