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1、微生物检查方法验证,介绍内容,一、微生物的基础知识二、微生物检查方法验证,微生物基础知识,微生物（microorganism,microbe）是一些 肉眼看 不见的微小生物的总称。微生物（microorganism）包括细菌、支原体、螺旋 体、衣原体、立克次体、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放 线菌）等。,微生物的特点,种类多 分布广 迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，只占地球上 实际存在的微生物总数的20%。,微生物的特点,各体小，表面积大 物体的表面积和体积之比称为表面积，大肠埃希菌 的表面积是人的30万倍。,微生物的特点,吸收多 转化快 如大肠埃希菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身
2、重量2000倍的数量，而人体则需要40年之久。,微生物的特点,适应强 易变异 多数细菌能耐0196的低温；硫细菌可在250300的高温条件下正常生长；一些嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活；产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能保藏几十 年、几百年。,微生物的类群和形态结构,微生物按其结构、化学组成及生活习性等分为三大类：原核细胞型：细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体等 真核细胞型：真菌 非细胞型：病毒 噬菌体,细菌的繁殖,细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点是具有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。了解细菌的基本特性、细菌的鉴别，对新药的研发和防止药品污染，保证
3、药品质量具有重要的意义。,细菌的形态,-细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观察难以看到，其结构和形状须经过显微镜放大数百倍至上千倍才能 观察。-一般以微米（m）作为测量单位。-在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌和螺杆菌。经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大类：革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。,细菌的形态,细菌的形态,真菌（fungus；eumycetes）是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过10万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。,细菌的形态,真菌的形态具有多样性，大小不一，大的
4、用肉眼可以看到，小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母菌（yeast）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。,药品污染常见的真菌,毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属-毛霉属（Mucor Micheli ex Fries）毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分高的粮食及食品的霉烂变质。,毛霉属的分枝类型：1.单生（不分枝）2.总状分枝 3.假轴状分枝毛霉的孢子囊：1.孢子 2.膜 3.囊轴 4.孢子囊柄,根霉属（RhizopusEhrenberg）,根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅速蔓延生长，引起粮食
5、及食品的腐烂。,根霉A：1营养菌丝 B：2.匍匐菌丝 3.假根 4.孢囊柄 C：孢囊放大图 1.囊壁 2.囊轴 3.囊托,曲霉属（Aspergillus）,曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多细胞。本属的常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的致癌性。曲霉 1双层小梗分生孢子头 2.单层小梗分生孢子头 3.分生孢子梗基部足细胞 4.双层小梗的细胞微结构,常见青霉分生孢子梗,青霉属菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有9个种，其中展
6、青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和致癌性；,霉菌菌落形态,霉菌在孟加拉红培养基上的形态,酵母菌显微镜下形态,微生物检查法,微生物限度检查方法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括 细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。检查方法 多用平皿法、薄膜过滤法、涂抹法和 MPN 法，国家药典规定应用经验证合格的方法。,检查方法的验证,试验环境 无菌检查应在环境洁净度 10 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全 过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污 染的措施不得影响供试品中微生物的检出。检验依据 单向流空
7、气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。-2010版药典,隔离系统的应用,应用隔离系统重要的目的-是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次检出的要求。-是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度 须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。,-为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法 是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。-证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被
8、检供试品的微生物污染的检验。,方法验证的必要性,检验结果的影响因素,供试品的组分 抑菌剂、增溶剂、乳化剂及抗氧化剂，这 些 组分在一定浓度下对微生 物起一定的抑制作用也可对污染菌造成损伤。环境影响 不同类型的微生物及不同的存活状态对环境的 抗性是不同的。如培养基的质量、检验人员的操作误差等。,方法验证,试验全方面验证 如试验环境，培养基，供试液的制备，灭菌方法等全部进 行验证。当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试 品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检 验结果可真实的体现。,验证方法,菌液制备 50100cfu/ml。验证方法 试验组、菌液组、供试品对照组、释剂对照组
9、。结果判断 供试品组、对照组、稀释剂对照组的菌回收率 均不低70%。,方法验证,验证方法 按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的 方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算 各试验菌每次试验的回收率。,方法验证,试验菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉、枯草杆菌。菌液制备 同计数培养基的适用性检查。,方法验证,试验组-平皿法 取最低稀释级供试液1ml和50100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基(平行制备2个平皿)，按平皿法测定其菌数。-薄膜过滤法 取最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。,方法验证,-菌液组 所加的试验菌数。-供试品对照组 测定供试品本底菌数。-稀释剂对照组 用相应的稀释液替代供试品，加入试验 菌按试验组测定其菌数。考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。,方法验证,试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数试验组的菌回收率()=X100%菌液组的平均菌落数 稀释剂对照组的平均菌落数稀释剂对照组的菌回收率()=X100%菌液组的平均菌落数,谢谢,
