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1、微生物实验技术,微生物的鉴定,微生物的鉴定,实验3-1 微生物的形态观察实验3-2 细菌特殊结构的观察实验3-3 革兰氏染色法实验3-4 微生物大小测定与计数实验3-5 微生物的理化性能鉴定,实验3-1 微生物的形态观察,一、实验目的1.学习微生物涂片、染色的基本技术。2.掌握微生物的简单染色法。3.熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区别。二、实验原理 微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。,实验3-1 微生物的形态观察,在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不同的染液和染色方法。染色前必须
2、固定微生物，其目的有二：一是杀死微生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。,实验3-1 微生物的形态观察,三、实验材料1.菌种与染料 根据不同的菌种采用不同的染液，见表3-1和附录。2.仪器和其他用品 显微镜，接种环，解剖刀，镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦镜纸。,表3-1 不同微生物种类所使用的染液,实验3-1 微生物的形态观察,四、实验方法（一）细菌、酵母菌的染色 染色操作程序为：涂片干燥固定染色水洗干燥油镜观察。1.涂片 取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将接种环在火焰上灼
3、烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液12环涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过程见图3-1。,实验3-1 微生物的形态观察,图3-1 无菌操作及做涂片的过程,实验3-1 微生物的形态观察,2.干燥 将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。3.固定 手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过火焰23次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再加染料。4.染色 将涂片置于玻片搁架上，加适量
4、(以盖满菌膜为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色12分钟。5.水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。6.干燥和镜检 让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。,实验3-1 微生物的形态观察,（二）放线菌、霉菌的染色1.制片及染色 用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注
5、意避免产生气泡。2.镜检 先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。五、实验报告 绘出所观察到的各种微生物的形态。,返回,实验3-2 细菌特殊结构的观察,一、实验目的1.掌握芽孢染色的方法；2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征；3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,细菌的鞭毛极细，其直径通常为1020nm，只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观
6、察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱，不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,三、实验材料1.菌种 根据观察目的的不同，选用不同的实验菌种，见表3-2。2.染料及试剂 孔雀绿染色液
7、，硝酸银鞭毛染色液，黑色素水溶液（见附录），番红溶液，甲醇。3.仪器和用品 显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯等。,表3-2 细菌特殊结构观察所选用的菌种,实验3-2 细菌特殊结构的观察,四、实验方法（一）芽孢的染色1.涂片 取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固定。2.初染 加35滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上，用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本干涸。3.水洗 待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为止。4.复染 加番红液1滴，染色1min，水洗。5.镜检 干燥后用油镜观察。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,（二）鞭毛染
8、色1.菌种的准备 冰箱保存的菌种要连续移种12次，取新配制的营养琼脂斜面接种，2832培养1014h。2.载玻片的准备 玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。3.菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有12 mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,4.制片 取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温(或37温箱)自然干燥。5.染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3
9、5 min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1 min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。6.镜检 干后用油镜观察。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色，通常呈波浪形。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,（三）荚膜染色1.制片 在载玻片一端加一滴无菌水溶液，取少许培养72h的褐球固氮菌，在水滴中制成菌悬液，取一滴碳素绘图墨水与菌悬液充分混匀。另取一块载玻片作推片，将推片一端平整的边缘与菌液以300角接触后顺势将菌液拉向前方，使其涂成一薄膜，风干。2.固定 用纯甲醇浸没涂片，固定1min，立即倾去甲醇，文火干燥，勿使玻片发热。3.染色 滴加番红溶液，染色12min，细
10、水流适当冲洗，自然干燥。4.镜检 背景黑灰色，荚膜呈一清晰透明圈，菌体红色。,实验3-2 细菌特殊结构的观察,五、实验报告1.绘图表示枯草芽孢杆菌茵体的形状与芽孢的形状、大小及其着生位置。2.绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。3.绘图说明你观察到的细菌的菌体和荚膜的形态。,返回,实验3-3 革兰氏染色法,一、实验目的1.了解革兰氏染色的原理。2.掌握革兰氏染色的方法。二、实验原理 革兰氏染色法是细菌学中的一个重要的鉴别染色法。由于应用了结晶紫和番红两种不同性质的染料进行染色，故又叫复染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌分为两大类，菌体呈紫色者为革兰氏阳性菌，呈红色者为革兰氏阴性菌。,实
11、验3-3 革兰氏染色法,其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙酮）脱色等处理主要发生脱水作用，而使孔径缩小，通透性降低，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保留在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上红色。,实验3-3 革兰氏染色法,三、实验材料1.菌种 大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。2.染料和器材 显微镜，载玻片，草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液（见附录），95%乙
12、醇，番红染液，香柏油，二甲苯，擦镜纸。,实验3-3 革兰氏染色法,四、实验方法 1.涂片 挑取少许大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，分别涂片(涂片一定要非常薄)。也可采用“三区”涂片法：在玻片中央偏左和偏右方各加一滴无菌水，先挑取少量的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌在左右一方分别涂片后，再将左右方的菌液延伸于中间区，使大肠杆菌、金黄色葡萄球菌相互混合。2.干燥 室温自然干燥。3.固定 涂面朝上，在火焰上过23次。,实验3-3 革兰氏染色法,4.染色(图3-3)(1)初染 加草酸铵结晶紫染色液一滴，染色12 min，水洗。(2)媒染 滴加卢戈氏碘液冲去残水，覆盖约1min，水洗。(3)脱色 斜置玻片于一烧杯上
13、方，并在载玻片背面衬一白纸，滴加95%乙醇脱色，并轻轻摇动载玻片，直洗至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止(约0.5 min)。立即用水洗净乙醇，并轻轻吸干。(4)复染 加番红染液一滴染色2min，水洗。,实验3-3 革兰氏染色法,实验图3-3 革兰氏染色程序,1.加草酸铵结晶紫染12分钟；2.水洗；3.加碘液媒染1分钟；4.水洗；5.乙醇脱色约30s；6.水洗；7.番红复染约2分钟；8.水洗。,实验3-3 革兰氏染色法,5.干燥 先用吸水纸轻轻吸干，再晾干。6.镜检 先用低倍镜找到物像后，用油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。五、实验报告 简述观察到的两种细菌革兰氏染色的结果并绘
14、图（说明各菌的形态、颜色和革兰氏染色反应）。,返回,实验3-4 微生物的大小测定与计数,一、实验目的1.了解用测微尺测定微生物大小的方法；2.了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法。二、实验原理 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形的玻片，在载玻片中央有一条把5mm长度刻成50等分或把10mm长度刻成100等分的线(图3-2)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,测量时，将其放在接目镜隔板上来测量经显微镜放大后的细胞物像。目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数的不同而
15、异。即目镜测微尺上的刻度只是代表相对长度，所以在使用前须用镜台测微尺校正，以求得在一定放大倍数下实际测量时的长度。镜台测微尺是一个中央部分刻有一条长为lmm刻度的载玻片(比一般载玻片厚)，其上镶有一圆形玻片，其中lmm的刻度被精确等分为100小格，每格长0.01mm(图3-3)。因此长度固定不变，所以用镜台测微尺的已知长度，在一定放大倍数下，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度(图3-4)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-2目镜测微尺 图3-3镜台测微尺 图3-4镜台测微尺校准目镜测微尺情况,实验3-4 微生物的大小测定与计数,血球计数板可用于计数一定体积内的微生物个体数量。血球计数
16、板是一块特制的载玻片，玻片上有4条沟和两条嵴，中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央lmm2面积上刻有400个小方格(见图3-5)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-5 血球计数板的构造,1-盖玻片 2-计数室,实验3-4 微生物的大小测定与计数,血球计数板有两种规格，一种是将lmm2面积分为25个大格，每个大格再分为16个小格(2516)。如在血球计数板上刻有一些符号和数字(见图3-5a)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格：即0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；(1/400)mm2表示
17、计数室面积是lmm2，分400个小格，每小格面积是(1/400)mm2。另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(1625)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3(10-4mL)的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出lmL菌液所含的菌体数(见图3-6)。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,图3-6 两种不同刻度血球计数板的构造,实验3-4 微生物的大小测定与计数,三、实验材料1.标本 酿酒酵母，枯草杆菌染色标本片。2.仪器和用品 显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，血球计数板，移液管
18、，香柏油，二甲苯，盖玻片，擦镜纸等。四、实验方法（一）微生物大小的测定1.目镜测微尺的校正（1）将目测微尺装入目镜的隔板上，使刻度朝下；（2）把物测微尺放在载物台上，使刻度朝上，对准聚光器。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,（3）先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后转换高倍镜，再次调焦看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺的第一条线重合，顺着刻度找出另一条重合线。（4）记录两端重合线之间目镜测微尺和镜台测微尺各有若干格。各种放大倍数各测量3次，取其平均值。（5）因为镜台测微尺的刻度每格10m，所以由下式计算出用低倍镜、高倍
19、镜和油镜观察物体时，目镜测微尺每格的实际长度。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,（6）移去镜台测微尺，并将其洗净、晾干，放回盒内。例如，目镜测微尺5小格等于镜台测微尺2小格，则目镜测微尺上每小格长度为：2105=4m 用同法校正在油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度)进行，而且只能在特定的情况下重复使用。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,2.菌体细胞大小测定(1)取一张干净的载玻片，滴上一滴棉兰染色液或路戈氏碘液。(2)用接种环无菌操作取酵母菌少许制成水浸标本片。(3)取下镜台测
20、微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格(不足1格的部分估计到小数点后l位数)。测出的格数乘上目镜测微尺每格代表的长度即等于该菌的大小。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,一般测量菌体的大小要在同一涂片上测定1015个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小，而且是用对数生长期的菌体进行测定。3.用同法在油镜下测定枯草杆菌染色标本的长和宽。4.用毕后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测尺的油腻和手印，擦好油镜头。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,（二）微生物的计数1.稀释样品，为了便于计数，将样品适当稀释，使每
21、格约含45 个细胞。2.取干净的血球计数板，用厚盖玻片盖住中央的计数室，用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖玻片的边缘，菌液则自行渗入计数室，静置5 10min 即可计数。3.将血球计数板置于载物台上，用低倍镜找到小方格网后换高倍镜观察计数。需不断地上、下旋动微调节器，以便看到计数室内不同深度的菌体。,实验3-4 微生物的大小测定与计数,现以1625 规格的计数板为例，数四个角（左上、右上、左下、右下）的四中格（即100 小格）的酵母菌数。如果是2516 规格的计数板，除取四个角上四中格外，还取正中的一个中格（即80 小格），对位于大格线上的酵母菌只计大格的上方及左方线上的酵母菌，或只计下方
22、及右方线上的酵母菌。每个样品重复计数3 次，取平均值，再按公式计算每毫升菌液中所含的酵母菌数。酵母菌细胞数/mL=每个小格内细胞数400104稀释倍数,实验3-4 微生物的大小测定与计数,五、实验报告1.将实验结果填入下列空格目镜_倍，低倍镜_倍，高倍镜_ _，油镜 倍。高倍镜下，目镜测微尺_格：镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。油镜下，目镜测微尺_格镜台测微尺_格。目镜测微尺每格=_m。2.将测得的菌体大小记录于下表3-3中3.将计数得的菌体数量记录于下表3-4中,实验3-4 微生物的大小测定与计数,表3-3 菌体大小测量结果,表3-4 菌液中所含的酵母菌数,返回,实验3-5 微生物的理
23、化性能鉴定,一、实验目的1.了解细菌鉴定中常用的生化反应及其原理。2.了解不同种类的细菌对碳水化合物及含氮化合物的分解利用情况，从而认识微生物代谢类型的多样性。3.学习平板接种法及穿刺接种法。二、实验原理 由于各种微生物的新陈代谢不同，因此对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，故可利用化学反应来测定微生物的代谢物（这种反应称为生化反应），并以此作为鉴定微生物的依据。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,三、实验材料1.菌种 枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气杆菌，普通变形杆菌。2.培养基 淀粉培养基，葡萄糖蛋白胨培养基，蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵固体培养基等，见附录。3.试剂 卢戈氏碘液，40%Na
24、OH溶液，5%-萘酚溶液（乙醇配制），甲基红试剂，吲哚试剂（见附录），乙醚等。4.其他物品 无菌培养皿，无菌试管，接种环，酒精灯，接种针等。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,四、实验方法(一)淀粉水解试验 某些细菌可以产生淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。操作步骤如下：1.将盛有淀粉培养基的锥形瓶置于沸水俗中融化，然后取出冷却至50左右，以无菌操作倾入培养皿中约1520mL，待凝固后制成平板。2.翻转平皿使皿底朝上，用记号笔在其背面做好标记，以免菌种混淆。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,3.用接种环取少量枯草芽孢杆菌在平板的一边划“
25、+”字作为阳性对照菌；另取少量大肠杆菌或产气杆菌在平板的另一边划“+”字（图3-7），然后将培养皿倒置于37恒温箱中培养24h。4.观察结果 打开培养皿盖，滴加少量碘液于平板上，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，如菌体周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(二)乙酰甲基甲醇(V.P.)试验 某些细菌在糖代谢过程中，能分解葡萄糖产生丙酮酸，二个分子丙酮酸经缩合和脱羧生成乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。此为V.
26、P.试验的阳性反应。在试管中加入少量的-萘酚为颜色增强剂可使反应加快。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,操作步骤如下：1.分别接种大肠杆菌和产气杆菌于装有葡萄糖蛋白胨培养基的试管中，置于37恒温箱内培养2448h，有时需延长培养到10天。2.在已培养两天的试管内，先加入40%KOH溶液1020滴，然后再加入等量的-萘酚溶液，拔去棉塞用力振荡，再放入37恒温箱中保温1530min(或在沸水浴中加热12min)。如培养液出现红色为V.P.阳性反应。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(三)甲基红(M.R.)试验 有些细菌在糖代谢过程中，可把培养基中的糖分解为丙酮酸，丙酮酸再被分解为甲酸、乙酸、乳
27、酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示。甲基红的变色范围pH4.2(红色)pH6.3(黄色)。操作步骤如下：1.取葡萄糖蛋白胨培养液两支，一支接入大肠杆菌，另一支接入产气杆菌，置37恒温箱内培养48h。2.观察结果时，沿管壁加入甲基红指示剂34滴，若培养液变红色即为阳性，变黄色则为阴性。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(四)吲哚试验 有些细菌能氧化分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚无色，可与对二甲基氨基苯甲醛结合，生成红色的玫瑰吲哚。操作步骤如下：1.以无菌操作分别将产气杆菌和大肠杆菌接种在蛋白胨水培养中，置37恒温箱内培养48h。2.观察结果时，在培养液中加入乙醚12mL（使呈
28、明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚被溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上层，然后沿试管壁加入10滴吲哚试剂，如果有吲哚产生，则乙醚层呈现玫瑰红色。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,(五)H2S产生试验 某些细菌能分解含硫有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢遇培养基中的铅盐或铁盐等，会形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。操作步骤如下：1.取2支柠檬酸铁铵固体培养基，分别用穿刺接种大肠杆菌和普通变形杆菌，置37恒温箱内培养48h。2.观察结果，如培养基中出现黑色沉淀线者为阳性反应，同时注意观察接种线周围有无向外扩展情况，如有表示该菌具有运动能力。,实验3-5 微生物的理化性能鉴定,五、实验报告 将实验结果填入下表3-5。“”表示阳性反应，“”表示阴性反应。,表3-5 微生物的理化性能鉴定结果,
