生物工程中国药科大学.ppt

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1、生 物 工 程谭 树 华 博士、教授,中国药科大学生物制药学院,参考书目录,BOOKSMolecular Biology And Biotechnology(Edited by J.M.Walker and E.B.Gingold)Molecular Biotechnology Principles and Applications of Recombinant DNA(Edited by Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak)Pharmaceutical Biotechnology(Edited by Daan J A Crommelin and Robe

2、rt D Sindelar)现代生物工程 焦炳华、孙树汉主编现代生物技术导论 瞿礼嘉、顾红雅、胡苹 编著生物技术药物 马大龙主编基因工程原理与方法 孙树汉主编,JOURNALSNATURE BIOTECHNOLOGYTRENDS IN BIOTECHNOLOGY MOLECULAR BIOTECHNOLOGY,药物分类,第一章 绪论第一节 生物工程的概念生物工程（技术）：就是利用生物有机体（这些生物有机体包括从微生物至高等动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞或细胞器等）发展新产品或新工艺的一种技术体系。,现代生物工程被列为当今世界公认的七大高新技术之首（现代生物工程技术、航天工程技术、

3、信息工程技术、激光工程技术、自动化工程技术、新能源工程技术和新材料工程技术。生物工程之所以受到世界各国的如此重视，是因为它在解决人类所面临的诸如食物短缺、人类健康、环境污染和资源匮乏等重大问题上有着无可比拟的优势和巨大潜力。它已广泛应用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工和能源等领域，并以对人类社会生活产生了深远的革命性影响。,第二节 生物工程主要研究内容 1、基因工程 2、动物细胞工程 3、酶工程 4、微生物工程,生物技术发展史上的里程碑,第三节 生物技术制药的诞生与发展,生物技术药物（biopharmaceutics,Biotech drug):利用生物体、生物组织、细胞或其成分，综合应

4、用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。,其发展要追溯到1980年十月十五号，纽约股票交易所开盘后20分钟内，生物制药公司Genentech的股票价格从$35到$89,成为当时历史上上涨最快的股票。当时Genentech的年龄才4岁，其原因是在这之前两年1978年Genentech成功地分离了人胰岛素的两条链的基因，并转入了大肠杆菌宿主细胞，这样就有可能利用大肠杆菌生产人的胰岛素，从而解决某些糖尿病患者对猪胰岛素过敏的问题。,1982年世界上第一个基因工程药物药物诞生了，由美国Lilly

5、公司率先研制的重组人胰岛素经美国FDA批准投放市场，这标志着生物制药技术进入了一个新纪元，也给广大的制药企业带来了无限的商机。同时也向世人展示，以基因工程技术为核心的现代生物技术药物具有无限的发展应用前景和生命力。,据统计，全球生物工程制药产业的年销售额1998年为149亿美元，到2007年已增长到840亿美元，年增长速度连续10年保持在15%-33%，其中，销售额超过10亿美元的“重磅炸弹”就有29种。由此可见，虽然生物技术制药的发展只有短短20几年，但已成为发展最快的高新技术产业之一。,我国的生物医药产业也发展势头良好，截止至2006年4月，我国食品药品监督管理局(SFDA)已批准了35种

6、重组蛋白药物、治疗性抗体或基因治疗产品上市，至2006年底，约有50余种生物技术药物处于临床或临床试验中。,生物技术药物在临床上的应用,生物技术药物(biotech drugs，biopharmaceuticals）己广泛用于治疗癌症、艾滋病、冠心病、多发性硬化症、贫血、发育不良、糖尿病、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传疾病。,生物技术药物的类别,主要有三大类：1、重组治疗蛋白质（酶、细胞因子、激素）2、重组疫苗3、诊断或治疗用的单克隆抗体或基因工程抗体。,2008年美国处于临床试验的生物技术药物的分布图（按产品类型分）中国医药生物技术 2009，4（2）：89,2007 年销售

7、额最高的6大类生物技术药物 中国医药生物技术 2009，4（2）：89,2008年美国处于临床试验的生物技术药物的分布图（按适应症分）中国医药生物技术 2009，4（2）：89,第四节 美国及欧洲主要的生物技术药物公司,Genetics InstituteBayerCenteonGenentechGentocorBoehringer MannheimGalenus MannheimEli LillyOrtho BiotechHoechst AG,Aventis PharmaceuticalsGenzymeSchwartz PharmaPharmacia and UpjohnBiotechnol

8、ogy GeneralSeronoOrganonAmgenDompe Biotec,Schering PloughHoffman-la-RocheChironBiogenPasteur Merieux MSDImmunomedicsNovartisAbbottWyethUnigene,ImmunexBedex LaboratoriesMerkSmithKline BeechamMedeva PharmaCytogenMed ImmuneRocheIsis PharmaceuticalsSanofi-Sythelabo,（安进）创建于1980年，位于美国加洲Thousand Oaks，靠近加州大

9、学和加洲理工学院。起初由于无产品上市，于1983，1986，1987通过公开发行股票募集资金维持公司生存。美国Nasdaq股票市场代号为AMGN。20世纪后10年是生物技术飞速发展的10年，1989年6月该公司第一个产品重组人红细胞生成素(erythropoietin，简称EPO)获得美国FDA批准，用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和HIV感染治疗的贫血1991年2月公司第二个产品重组粒细胞集落刺激因子(filgrastim，G-CSF)获得美国FDA批准，其适应证为肿瘤化疗引起的嗜中性白细胞减少症。1992年安进公司首次跻身财富500强。此外,还有白细胞介素1受体拮抗剂Kineret和抗类风

10、湿性关节炎融合蛋白Enbrel等。公司致力于研发新的蛋白药物，应用于肿瘤、炎症、骨疾病、神经疾病、代谢性疾病和肾脏疾病的治疗。,三个先驱生物制药公司Amgen,Biogen和Gennentech,Biogen是全球老牌生物技术公司之一，始建于1978年，并于2003年与制药公司Idec合并组建成Biogen Idec公司。总部位于美国麻省，在欧洲，加拿大，澳大利亚和日本有分支机构。主要研发癌症，精神病，皮肤病和风湿病相关药物。主要品种是老药Avonex（野生型干扰素，适应症为多发性硬化症）和Rituxan（与Genentech共同研发的瞄准癌细胞蛋白质的单克隆抗体药物，它可以挑选出癌细胞，交给

11、免疫系统摧毁，适应症为肿瘤。）。2005年，新药Tysabri（人源化单抗，适应症为多发性硬化症）因安全问题撤市使股价受重大打击，从70美元下跌至35美元/股左右。2006年，Tysabri因疗效确实，在严格限制下重返市场，现有17000名患者使用该药，没有再发现致命和严重副作用。,Genentech(基因技术公司）美国历史最久的生物技术公司，规模和实力仅次于安进。它成立于1976年。创始人是风险投资家罗伯特.斯万森(Robert A swanson)和生物化学家赫伯特玻意尔博土(DrHerbert Boyer)。70年代早期，玻意尔(Boyer)和遗传学家史丹尼科恩(Stanley Cohe

12、n)开创了个名为DNA重组技术的科学新领域。斯万森(Swanson)为这一突破激动不已，他打电话给玻意尔请求会晤。玻意尔同意给这位年轻的创业者十分钟的时间。斯万森对这一技术的热心和对其商用前景的坚定信念是富有感染力的，会晤由10分钟延长到了3个小时：其结果是，基因工程技术公司宣布诞生。,1980年，基因技术公司上市，一个小时内每股从35美元剧涨至88美元，公司的身价因此激增至3500万美无。这一事件是美国股市涨幅最大的案例之一。上市有10个基因工程药物，其中包括:人生长激素“Nutropin”,抗体药物“Herceptin”和“Rituxan”,溶栓药物“Activase”和“TNKase”.

13、该公司目前处于临床试验阶段的还有20个左右的产品 基因工程公司作为美国最早和最大的生物技术类风险投资支持的企业，代表着美国生物医学产业未来的发展的方向，同时也为世界风险投资事业的发展提供了新的思路,人类终于有了第一个转基因动物生产的药物上市用于临床。该药品从经过基因修饰奶山羊分泌出的羊奶中提取纯化，是用于治疗一种被称为遗传性抗凝血酶缺乏症的疾病。这种药物的上市标志着转基因动物药物真正迈入产业化时代。,2009年2月6号美国FDA批准了首个利用转基因山羊生产的重组药物Atryn（由美国麻省生物技术公司 GTC Biotherapeutics生物技术公司）上市。,第五节 发展前景 医药生物工程一直

14、是生物工程技术中发展最快、最活跃的领域，也是各国生物工程研究开发的重中之重，是生物工程产业最为成熟，竞争最为激烈的领域。近年来，基因组学、蛋白质组学、生物信息学、转基因技术、干细胞和克隆技术、生物芯片技术等一系列新兴技术的发展，为促进医药产业的发展提供了新的途径和思路，医药生物工程技术正在成为整个医药产业发展最重要的技术推动力。所以生物工程医药产业依旧是朝阳产业。,第二章 基因工程与蛋白质工程,基因工程是指在分子水平上按照人们的设计方案将DNA片段（目的基因）插入载体DNA分子（如质粒、病毒等），从而实现DNA分子体外重组，产生新的自然界从未有过的重组DNA分子，然后再将之引入特定的宿主细胞进

15、行扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传性状的技术。基因工程有时也称为重组DNA技术或分子克隆技术。,Genetic Codon,一、基因工程的概念及其基本过程,典型的主要步骤有：1、目的基因(靶基因)的制备；2、载体的选择与制备；3、目的基因与载体的连接；4、将重组DNA分子转入宿主细胞，并 在其中进行复制、扩增；5、重组子的筛选与鉴定；6、表达产物的鉴定；7、工程菌（细胞）的大规模培养；8、表达产物的分离与纯化。,Cloning into a plasmid,基因工程必备的四个工具,工具酶载体目的基因(靶基因)宿主细胞,二、工具酶,1.限制性内切酶（restriction endonuclea

16、ses）：是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。这类酶的发现和应用促进了DNA序列测定和基因工程技术的发展。它们已成为分子生物学研究和基因工程技术中不可或缺的工具酶。1968年，科学家E.Smith首次从大肠杆菌K12和K13中提取出了限制性内切酶。由于它们能够在DNA上寻找特定的切点，然后进行交错或平齐切割，因此又称作“分子剪刀”，迄今已发现400多种。现在基因工程技术中所使用的限制性内切酶几乎都已商品化，在各生物技术公司（如国内的华美、美国的Promega等公司）都能购买到。,限制型内切酶的命名 为了对这些酶进行合理地命名，和D.Nathans于1973年提出了限制性内

17、切酶的命名规则：（1）取该酶的产生菌的属名的第一个大写字母和种名的第一、二个小写字母组成酶基本名称；（2）若具有不同株，取其株系的第一个字母加于酶名称之后，需大写；（3）若同一株中发现多种内切酶则用大写罗马字码I、II、III、IV表示分离次序先后。以下是几种常见内切酶的命名情况,限制型内切酶的性质 基因工程技术中使用的酶属于II型限制性内切酶，它一般具有以下特性：识别序列：大多数酶的识别序列为4-6个双重对称（回文结构）的核苷酸，少数酶识别更长的序列。切割方式：（1）在对称轴两侧相对的位点上，交错切割，形成带有1到4个核苷酸长度的5，端突出或3，端突出的粘性末端。所谓粘性末端是指含有几个核苷

18、酸单链的末端，可通过粘性末端碱基互补，使不同的DNA片段发生退火，有利于连接酶的连接。（2）在识别序列双重对称轴上同时切割双链，产生平齐末端或钝端。以下是几种典型的限制性酶的识别序列与切割方式。,5端突出,3端突出,平齐末端,反应条件：（1）一般限制性内切酶的最适反应温度为37,但也有例外，如Sma则为25。（2）不同限制性内切酶反应所需的离子强度也不一样，一般分高、中、低三种。在进行操作时可供应商所提供的反应体系与反应温度进行。,同裂酶与同尾酶同裂酶（isoschizomer）：又称异源同工酶，指不同来源但识别和切割序列完全相同的限制性内切酶。如HpaII和MspI(CCGG)；不完全同裂酶

19、：指识别序列相同，但切割位点不同的酶，如SmaI（CCCGGG）和Xma I（CCCGGG）；同尾酶：来源及识别序列均不相同，但切割后行成的限制性片段具有相同粘性末端的，当它们消化后产生的片段互相连接后，这两种酶的识别序列一并消失。如：Sal I（GTCGAC）和Xho I(CTCGAG)Sal I片段 Xho I片段 5，G，+TCGAG 3，3，CAGCT C 5，5，GTCGAG 3，3，CAGCTC 5，,星号活力（第二活力）迄今所发表的第II型限制性内切酶的识别序列都是在一定消化条件下测出的，当条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至同一种酶可识别和切割更多的位点。如EcoR I通常只

20、识别GAATTC，但是在低盐（50nM），高pH（8）和甘油存在的条件下，EcoR I识别序列与原来不同，产生EcoR I星号酶活，除中间四个碱基A不能变成T、T不能变成A外，识别序列的6个碱基位置上仅在一处与原来序列不同的任何一个碱基的替代，EcoR I照旧能识别此序列（如GAATTA，AAATTC，GAGTTC等）。因而EcoR I的识别序列在DNA上出现的频率要比EcoR I识别序列的出现频率高15倍。此外，BamH I也有类似情况。因此，为了获得一种限制性内切酶的最适反应速度和理想的消化专一性，必须坚持应用推荐的反应条件。,酶的储存 纯化后的限制性内切酶酶制剂，通常储存在含有50%甘油

21、的缓冲液中，保存于-20，不会冰冻，一般可储存一年以上。储存酶的温度不能过低，若低于-20，可使50%甘油冰冻，而反复冻融会导致酶严重失活。保存酶液的缓冲体系，不同的酶略有差异,但不外呼是50-100mMKCl即100mM Tris-HCl pH7.5,0.1mM EDTA,1mM DTT，同时加入BSA浓度至100-200g/ml,以保护酶蛋白不失活。所用BSA质量要求很高，一定不能含有核酸酶类的活性。,酶活力单位的定义 在50l缓冲液中，于最适反应条件和温度下保温1小时，能将1gDNA完全降解所需的酶量即为1个酶活单位。需要说明的是，所谓一个酶单位降解1gDNA是指在测活时所用的特定反应体

22、系和DNA种类下完成的，若盐浓度、pH等因素，尤其是DNA的种类改变后，并不一定一个酶单位还能完全消化1gDNA。如，降解1g的pBR322所用的酶量要大于水解1gDNA所用的酶量。,2 T4DNA连接酶 基因工程最常用的连接酶是T4DNA连接酶（T4 DNA ligase）,它可将两段乃至数段DNA片段拼连起来，起到分子“缝合”的作用。该酶是从T4噬菌体感染的E.coli 中分离得到的分子量为68KDa的单链多肽酶，它可催化一个DNA片段的3羟基和另一个DNA片断的5磷酸基团之间形成磷酸二酯键，连接时需要ATP为辅助因子。该酶既可连接粘性末端，也可连接齐平末端，是应用最广泛的连接酶。T4DN

23、A连接酶最适反应温度为37，但为了增强两段DNA片段粘性末端互补碱基之间形成氢键的稳定性，实际反应温度一般为415。,其它常用修饰酶DNA聚合酶 分子克隆中 经常会使用各种DNA 聚合酶，从而在有模板存在时催化合成与模板序列互补的DNA产物。常用的DNA聚合酶有大肠杆菌聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow 片断）、T4DNA聚合酶，T7DNA聚合酶，耐高温的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）,反转录酶等等。不同种类的DNA聚合酶来源不同，酶学特性及用途也各异，其应用涉及到DNA分子的体外合成，定点突变，DNA探针的标记，DNA序列测定，基因文库的构建，聚合酶链反应（PCR）等等

24、诸多方面。,T4多核苷酸激酶 该酶可催化ATP的磷酸基团转移到DNA或RNA的5一OH上。可分为正向反应及交换反应。该酶的一个用途是用同位素标记DNA片段的5末端，反应底物包括化学合成的寡核苷酸片段的5一OH和DNA酶切所得的5粘端或平端，后者必须先用碱性磷酸酯酶去除5一P，再加上P，这种方法不适用于3粘端。另一用途是在化学合成的寡核苷酸片段的5一OH上加上磷酸基团，以便进行化学合成基因的拼连。碱性磷酸酶 包括细菌碱性磷酸酶(BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)，其作用是去除DNA、RNA、NTP和dNTP的5磷酸根。在基因克隆时可用于去除载体DNA片断的5P，以防载体自身环化；此外，在用32

25、PATP对基因探针进行5进行标记前，可用该酶去除其5磷酸基团。,基因工程载体 目的基因（靶基因）必须与载体DNA重组后才能导入宿主细胞并进行扩增和表达，从而获得大量的目的基因克隆以及表达产物。这种可将外源DNA载入宿主细胞的工具便称为载体（vector）。一般作为基因工程载体需要满足以下条件：1、能在宿主细胞中独立复制繁殖；2、有一定的选择标记，易于识别和筛选；3、可插入一段较大的外源DNA，而不影响其自身的复制；4、有合适的限制性内切酶酶切位点，以便进行DNA重组与克隆。目前基因工程载体主要有三类：质粒：各种质粒，用于基因克隆与表达；噬菌体：噬菌体、粘粒、M13噬菌体等；病毒：SV40等。,

26、质粒 质粒DNA是微生物细胞中分子量比染色体DNA小得多的共价、闭合、环状双链DNA分子（个别除外，如酵母自杀质粒是RNA），是一种存在于染色体外的能自主复制的遗传因子，质粒通常带有与细胞的主要代谢活动无关的一些基因，例如抗生素抗性基因，产生细菌素的基因，碳水化合物分解代谢的基因和诱发肿瘤的基因等等。由于质粒的存在，宿主细胞往往被赋予新的表型，当把一个含抗药性基因的质粒转入细胞之后，原来无抗药能力的细菌则表现出抗药新表型。,质粒的生物学性质(1)质粒的复制 具备复制起点（原点）是DNA分子在宿主细胞中进行复制的一个必要条件。根据复制控制类型的不同质粒分为严紧型质粒与松弛型质粒，前者受宿主细胞复

27、制作用的严格控制，因此，每个细胞中只含有一至几个拷贝；而后者则受宿主细胞的控制不严，它们在每个细胞中的数目可达10-500个拷贝，当用氯霉素抑制细胞蛋白质合成时，质粒拷贝数可扩增至数千个。现在使用的质粒载体绝大多数都是松弛型质粒。,（2）质粒不相容性（incompatibility)指在没有选择压力的条件下，两种亲源关系密切的质粒不能共存于同一宿主细胞中的现象。原因是它们的复制子相同，所用的复制系统也相同，故在复制和分配到字细胞的过程中互相竞争。细菌生长几个世代后，量少的质粒就完全消失。至今已发现30个以上的不相容组，只有属于不同不相容组中的质粒才能共同存在于同一个宿主细胞中。（3）选择标记

28、当质粒DNA转化宿主细胞时，只有极少部分宿主细胞接受了DNA，所以需要利用质粒编码的选择标记将转化成功的宿主细胞（阳性克隆）从大量的宿主细胞中筛选出来。质粒最常用的选择标记是抗生素抗性基因，这些抗性主要包括氨苄青霉素（Amp或Ap）、四环素(Tet)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan或Km)和新霉素（Neo）等。例如，对氨苄青霉素有抗性的质粒，一般写作Apr；而对该药敏感的质粒则写作Aps。,常见质粒载体 由于野生质粒往往存在许多不足，因此现在使用的质粒载体一般都是人工构建的，从而使其满足以下条件：1、其分子结构中带有多个单一限制酶切位点，2、构建后的重组质粒必须易于转化；3、带有一个以上强选

29、择性标记；4、分子量较小，属松弛型复制控制，便于操作；5、宿主范围小，无感染性。pUC 系列载体是目前应用较广的一组可用于克隆、测序和表达外源基因的非常有用的载体系列。这类载体具有以下特征：（1）、高拷贝数，每个宿主细胞中拷贝数可达500-700个；（2）、在相应的宿主中可出现互补，便于进行蓝、白斑筛选；（3）、pUC 系列载体是成对出现的，它们之间除多克隆位点排列方向相反外，其它并无区别。,2007/10/10,噬菌体结构与性质噬菌体分头部和尾部，其DNA存在于头部，当其尾部附着在大肠杆菌宿主表面时，其DNA通过尾部注入宿主菌。噬菌体基因组是一线性双链DNA分子，长48502bp，含61个基

30、因，其两端各有长为12个碱基的互补单链。进入宿主后，粘性末端相连（此处称COS位点）形成环状DNA分子，根据噬菌体三个编码基因（cI、cII、cro）产物间的平衡情况进入溶菌或溶源生活周期。在溶菌方式中，环状DNA分子被复制许多倍，噬菌体基因产物大量合成，并组装成子代噬菌体颗粒，最终宿主细胞裂解，释放出许多成熟的噬菌体颗粒。在溶源方式中，噬菌体DNA通过专一位点重组整合入宿主DNA分子中，随宿主菌DNA一起复制并转入子代细胞中。,噬菌体DNA克隆载体 噬菌体DNA可分为三个部分：左臂、右臂及中央区。溶菌生长所需的基因位于基因组的左、右臂，而溶源化生长所需的基因都集中在中央区，若用外源DNA置换

31、这个区域的基因，并不影响噬菌体颗粒的形成。这便是噬菌体DNA可作为载体携带外源基因的基础。野生型噬菌体DNA上有许多常用限制性酶切位点（如EcoRI、HindIII等），不能直接作为载体，需要经过人工改建才能成为有价值的克隆载体，改建工作包括：1、消除或改变DNA必需区的不必要的限制性酶切位点；2、在可替代区构建所需的酶切位点；3、其它结构上的改建，以提高载体效用，如插入一个外源启动子，使载体具有表达外源基因的功能等等。,载体的种类 载体可分为插入型和置换型两大类，前者具有单一酶切位点可供外源DNA插入，后者有成对的酶切位点，两酶切位点间的DNA片段可被外源DNA片段置换。常见的载体有gt系列

32、（置换型载体），常用于cDNA文库构建；Charon系列（分插入和置换两种类型）,可容纳0-24Kb大小的外源基因。载体的特点载体具有以下优点：1、可携带较长的外源DNA片段，最长达18-22Kb;2、重组DNA分子包装成噬菌体颗粒后具有更高的转染能力；3、重组的噬菌体容易筛选和储存。此外，为获得较高的感染宿主能力，DNA构建的重组DNA分子必须包装成完整的噬菌体颗粒，这对于保证基因文库的完整性非常重要。体外包装是指人为地将重组DNA分子与高浓度噬菌体头部前体、包装蛋白和尾部蛋白混合，自动包装成完整的噬菌体颗粒。包装蛋白可以自己制备也可以从商家购买。,粘粒（Cosmid）粘粒又称柯氏质粒，是构

33、建真核生物基因文库的的重要载体。载体所克隆的外源片段通常不超过15-20Kb,然而有些真核基因含有多个内含子，长度超过20Kb，为满足克隆大片段的需要，于是构建出粘粒载体。粘粒大小为4-6Kb,而插入片段则可大至29-45Kb。粘粒是由质粒和噬菌体DNA的粘性末端构建而成的载体。重组的粘粒可进行体外包装，包装好的颗粒可有效地感染大肠杆菌，这样就避开了大质粒转化的困难，同时它在宿主菌内也可象质粒一样复制增殖。粘粒是包含cos序列的质粒，不能裂解宿主菌形成噬菌斑。在筛选重组子时，菌落筛选比嗜菌斑筛选所需实验步骤多，一次筛选的菌落数也远不及嗜菌斑多。因此，在构建基因文库时，首选噬菌体载体，只有在克隆

34、大片段基因时才选用粘粒构建基因文库。,粘粒在使用方法上与噬菌体载体有所区别。以粘粒pJB8DNA为例，首先建立两个酶切反应，分别用HindIII和SalI进行消化。由于这两个限制酶切位点分别位于cos位点的两侧，所以切割后便形成了“右边”cos片段和“左边”cos片段。用碱性磷酸酶进行处理以去除cos片段的5-末端磷酸基团，以防止载体自连或载体与载体之间的连接。然后对上述去磷酸基团的cos片段反应物再用BamHI进行消化，这样便可以得到具有BamHI粘性末端的cos片段（一个为大片段，另一个为小片段）。将这两个大小大片段与MboI或Sau3A部分消化并作了脱磷处理的真核生物DNA（3247Kb

35、）进行混合连接。结果便会形成一种由“左边”cos片段、一条长度为3247Kb的插入片段和“右边”cos片段组成的可包装的重组DNA分子。转化大肠杆菌宿主菌后便可以像质粒一样进行复制，并赋予宿主细胞氨苄抗性。,用粘粒载体进行克隆（方法之一）,M13噬菌体载体 M13是一种丝状的大肠杆菌噬菌体，只感染具有F因子的雄性E.coli，其基因组是一单链环状DNA分子，全长6407个核苷酸。噬菌体单链DNA（+）链进入细胞后，便复制出与之互补的（-）链DNA，形成复制型双链DNA（RFDNA），RFDNA通过滚环复制可积累100-200个RF拷贝，与此同时，（+）链积累，并被组装成成熟的噬菌体颗粒，释放至

36、培养基中，但并不引起细菌裂解。被M13噬菌体感染的细菌生长缓慢，在平板培养基上形成浑浊的“嗜菌斑”。不仅M13噬菌体可以侵染细菌，而且其单链或RFDNA无需包装也可直接转化雄性E.coli，这为M13用作基因工程载体提供了极大的方便。,M13 噬菌体载体M13mp18/19图谱,M13 噬菌体载体M13mp18/19多克隆位点序列,mp载体系列皆由M13噬菌体改造而来，在M13基因II和基因IV之间的非编码区插入LacZ的调控序列及其N端146个氨基酸编码序列，以便利用互补对重组子进行蓝白斑筛选。在LacZ基因内引入一多克隆位点（MCS）以便进行外源基因的克隆。如，M13mp18和M13mp1

37、9是一对常用载体，它们的唯一区别在于LacZ基因内的多酶切位点顺序正好相反。由于重组丝状噬菌体的基因组趋于不稳定，因此丝状噬菌体载体并不用于外源DNA片段的常规克隆和增殖，主要用来制备已经克隆于另一类载体（质粒或嗜菌粒）中的DNA片段的单链拷贝。RF型DNA可以象质粒那样进行分子操作，而单链DNA（ssDNA）分子则可以在下列工作中用作摸板：（1）双脱氧链终止法进行DNA序列测定；（2）进行单链DNA探针的标记；（3）寡核苷酸定点诱变。,动物病毒载体 病毒载体在昆虫细胞及哺乳动物细胞的基因工程中应用较多，常见的哺乳动物细胞病毒载体有SV40（猿猴病毒）、BPV（牛乳头瘤病毒）、反转录病毒、痘病

38、毒等；昆虫病毒载体有杆状病毒等。SV40病毒基因组为共价闭合环状DNA（cccDNA），长5243bp，基因组分早期和晚期两个功能区，两功能区间含DNA复制起始位点。早期区在整个裂解周期都被转录，并通过不同剪切方式产生大T和小t抗原的两种mRNA；晚期区仅在DNA复制后才进行转录，编码病毒外壳蛋白VP1、VP2、VP3。,完整的SV40病毒粒子不需要改造便可作为克隆载体。一般以早期区取代与晚期区取代两种取代方式构建重组子。若晚期区被取代，则需用早期区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒与之混合感染宿主，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒产生的早期基因产物一起形成完整的病毒颗粒，反之亦然。直接用

39、SV40作为载体有以下缺点：（1）、容量小，外源片段不大于2.5Kb；（2）、感染宿主范围有限，只能在猴细胞中复制；（3）、用辅助病毒进行混合感染时，有可能发生重组产生野生型的SV40带来危险。因此，目前绝大多数实验室所使用的SV40载体都是经过改造的病毒载体质粒。如pSV就是由SV40衍生出来的载体系列，同时将tk、dhfr、neo、cat等标记基因与pSV40质粒重组，构建出适用于不同目的的表达载体(pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr)，这类载体适合在哺乳动物细胞中瞬时表达克隆的外源基因。,目的基因的制备 要实现某一目的基因（靶基因）的表达，首先就必须克隆得到该基因。基

40、因克隆的方法很多，即使是同一类的方法也有可能在技术路线或细节技巧上有所差异。目前应用较多的基本方法主要有：1 基因文库的建立与筛选；2 通过聚合酶链反应（PCR）方法得到；3 人工化学合成方法制备。,基因文库的建立与靶基因的分离 基因文库（gene library 或 gene bank）主要分两类：基因组文库和cDNA文库，两者获取核酸的来源不同。基因组文库是通过机械剪切或限制性酶消化将某种生物的基因组切成一定大小的片段，然后与合适的载体（噬菌体载体或粘粒）连接，并导入宿主细胞中进行扩增，从而获得一群重组DNA克隆的混合物，其中包含了该生物的各种基因或基因组。原核生物和低等真核生物，由于基因

41、结构简单，基因组文库可以作为直接提供目的基因的来源。,在高等生物中由于结构基因是由外显子（exon，蛋白质编码序列）与内含子（intron,非蛋白质编码的间隔序列）排列组成的，其转录物需要经过剪接（splicing）去除内含子，使外显子连接加工产生成熟的mRNA，为获得完整的能直接进行表达的真核生物编码目的基因，就必须构建cDNA（complementary DNA）文库。所谓cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它是成熟mRNA的拷贝，不含有任何内含子序列，可以在任何一种生物体中进行表达。将细胞总mRNA反转录成cDNA并获得克隆，由此得到的cDNA克隆群体便称为c

42、DNA文库，它代表了某种生物的全部mRNA序列，即蛋白质编码信息。,构建cDNA文库主要包括以下几个步骤：（1）、mRNA的分离。真核细胞mRNA分子是单顺反子，具5端帽子结构（m7G）和3多聚腺苷酸(poly A)尾巴，这为mRNA的提取提供了极大的方便。目前，以利用寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT）-纤维素柱层析法提取最为常用，其原理是oligo dT与poly A之间可形成氢键，从而将mRNA分子有效吸附。值得注意的是，提取的mRNA愈完整，构建的cDNA文库质量也就愈高；其次是，提取的mRNA不能有DNA污染。（2）、cDNA第一条链的合成。利用Oligo-dT或610个核苷酸长的寡核

43、苷酸随机引物与poly(A)mRNA杂交，形成引物，在反转录酶AMV或MLV作用下，以mRNA为模板，利用4种脱氧核苷三磷酸（4dNTPS），从引物3端OH基开始合成sscDNA。（3）、cDNA第二条链的合成。碱处理去除DNA/RNA中的mRNA,sscDNA3 末端自身环化，形成发夹结构，以此为引物在E.coliDNA聚合酶I或Klenow片段和反转录酶的共同作用下，利用4dNTPs完成cDNA第二条链的合成。在核酸酶S1作用下，将发夹结构和另一端的单链切除。,（4）、cDNA与载体的连接。最常用的载体有gt10和gt11两种。它们都具有供外源cDNA片段插入的EcoRI位点。由于合成的c

44、DNA为平头末端，需在其两端加上EcoRI连接子，再经EcoRI甲基化酶甲基化，以免在酶切产生粘性末端时cDNA内部的EcoRI位点被切开。（5）、噬菌体的包装及转染或质粒的转化。若用质粒作载体，cDNA与载体连接后可直接转化宿主细胞；若采用噬菌体作载体，必须体外包装成噬菌体颗粒感染宿主菌。,从cDNA文库中筛选目的克隆主要有以下方法：（1）、核酸杂交。这是从cDNA文库中筛选目的克隆的最常用、最可靠的方法。根据靶蛋白纯品的氨基酸序列，合成一组所有可能的简并寡核苷酸序列，其中至少有一条会与目的cDNA克隆完全配对。用它作为探针可筛选出目的cDNA克隆。（2）、免疫法。在构建cDNA文库时，选用

45、可使外源DNA表达的载体（如gt10和gt11等），文库构建后，可用靶蛋白的特异性抗体筛选目的cDNA克隆。除构建cDNA文库外，对于一些高丰度表达、容易纯化的蛋白质，可以直接通过该蛋白质的单克隆抗体纯化该基因的核糖体，再洗脱下编码该蛋白的特异mRNA，直接反转录成cDNA，进行基因克隆，从而直接获得该特定基因的克隆。,聚合酶链反应技术（Polymerase chain reaction，简称PCR）,PCR技术由Mullis于1985年创立，1987年获得专利，1989年被美国著名Science杂志列为十项重大科技发明之首，1993年获诺贝尔化学奖。如今，PCR技术已成为分子克隆工作中必备的

46、基本技术之一，并广泛渗透到医学分子基因诊断、法医、考古学等诸多领域。可以说PCR技术发明给整个生命科学都带来了一场革命，同时也为目的基因的快速克隆提供了一种有效的手段。,PCR基本原理 PCR技术可在短时间内于试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。它实际上是在欲扩增的目的DNA的两侧设计一对正向和反向引物，在模板DNA以及四种脱氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的条件下由TaqDNA聚合酶所引导催化的DNA扩增酶促反应。PCR由三个基本反应组成：（1）高温变性（denaturation）:通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；（2）低温退火（annealling）:使温度

47、下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行配对结合；（3）适温延伸（extension）：在TaqDNA聚合酶、4dNTP s及Mg2+存在下，引物3端向前延伸,合成与模板碱基序列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延伸便构成一个循环，每一次循环产物可作为下一次循环的模板，数小时之后（约25-30次循环），介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105-107拷贝。,由此可知，我们可以利用目的基因两侧的核昔酸序列，设计一对和模板互补的引物，十分便捷地以基因组、或己克隆在某一载体中的基因为模板扩增出所需的目的基因片段。如以真核生物总为模板则可获得无内含子及不带调控序列的结构基因。此

48、外，通过在引物的端添加额外的与模板不互补的所需序列，如限制性酶切位点、起始密码子、核糖体结合位点、启动子、终止密码及终止子等，便可以将其引入目的基因中，从而方便进行目的基因的克隆、表达与调控研究。,PCR反应的影响因素 影响PCR反应的因素很多，概括起来主要有以下几种：（1）引物。它在整个PCR扩增体系中占有十分重要的地位，为了提高扩增效率和特异性，一般遵循下列原则：A、引物长度以15-30核苷酸为宜，过短会使特异性降低，过长则成本增加，且也会降低特异性；B、碱基应尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量应在45-55%左右；C、引物内部无发夹结构（发夹是指发夹柄至少有4个碱

49、基，而发夹环至少有3个碱基）这种结构尤其应避免在引物3端出现。D、两引物间应避免出现二聚体，因为一旦出现二聚体，引物就不能很好地与模板结合（二聚体是指引物序列之间至少有5个以上的碱基互补配对），尤其在引物3端不应有2个以上碱基互补；E、引物3端最好选A，其次选G、C，而不要选T；F、引物5端可加上限制性酶切位点及保护碱基，以便扩增产物进行酶切和克隆。,（2）模板。单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）以及由RNA反转录成的cDNA均可作为PCR模板。模板DNA可是线性分子也可是环状分子，然而前者略优于后者。PCR对模板纯度要求不严，样品可以是粗提物，但不可混有任何DNA聚合酶抑制剂

50、、核酸酶、蛋白酶及能结合DNA的蛋白质。尿素、SDS、甲酰胺等也会严重影响PCR反应效率。此外应避免交叉污染。（3）Mg2+浓度。TaqDNA聚合酶是一种Mg2+依赖酶，因此，反应体系中必须有Mg2+存在，然而保持适当的Mg2+浓度十分重要，因为Mg2+浓度过高或过低均会影响引物与模板的结合、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的形成以及酶的活性与精确性。（4）TaqDNA聚合酶。Taq酶的添加量必须适当,如过高会增加非特异性产物扩增，而酶量过低则又会降低产物量。此外，为了保证产物的正确率，可以采用高保真酶如Pfu酶、High-fidelity Taq酶等。,（5）温度循环参数。PCR涉及变