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1、碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化,实验目的:从兔肝中提取碱性磷酸酶的实验，培养同学综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。,实验原理：采用有机溶剂分步沉淀法，从兔肝中提取碱性磷酸酶。AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。,有机溶剂沉淀,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的
2、水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。,常用的有机溶剂沉析剂,乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小:60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22容易获取,有机溶剂沉析的特点,分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；,影响有机溶剂沉析的主要因素,温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共
3、沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.010.05mol/L样品浓度:0.52%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+,1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,进行匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。,在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。滤液加入等体积的冷
4、丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5M Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。,4.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清于另一离心管。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。,5.(1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清于离心
5、管，弃沉淀。(2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清，沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。,6.（1）其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min，取上清（弃沉淀）（2）上清中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min，弃上清（3）沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于比活性测定。,用于活性测定：用Tris-Mg(
6、AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、C液稀释5倍，D液不稀释。用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释50倍、B液稀释20倍、C液稀释5倍，D液不稀释。,(二)碱性磷酸酶的活性测定,实验原理：AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.810,需要镁离子作为激活剂。血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。,酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。,磷酸苯二钠,磷酸盐+,酚,AKP,酚+4-氨基安替比林,红色醌类衍生物,铁氰化钾,1.取
7、试管6支编号（体积单位为ml）,2.加入底物后,立即混匀,37 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应,混匀,静置15 min,510 nm比色（大比色杯）,AKP纯化程度鉴定,AKP纯化程度用酶的比活性反映。酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。,BCA法测定AKP蛋白浓度,BCA(bicinchoninic acid,二喹啉甲酸),Protein+Cu2+,OH-,Cu+,BCA 试剂,紫色复合物,(三)碱性磷酸酶的蛋白含量测定,1.取试管6支编号（体积单位为ml）,2.混匀后37水浴30min,562nm比色（小比色杯）,1.取试管6支编号（体积单位为ml）酶
8、活性测定,2.取试管6支编号（体积单位为ml）酶蛋白含量测定,1.取试管6支编号（体积单位为ml）,2.加入底物后,立即混匀,37 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应,混匀,静置15 min,510 nm比色（大比色杯）,722S型分光光度计使用方法,开机预热15min以上（打开盖预热）。转动波长选择钮，选用所需的波长。将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使空白管对准光路。按MODE 键选择trans模式。打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ 键，即能自动进行机械零点的调整，数码显示为0.000。盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按100%ADJ 键，
9、即能自动进行空白零点的调整，数码显示为100.0。（一次如有误差可再按一次）按MODE 键选择吸光度测定模式（ABS灯亮），数码显示自动转换为吸光度值0.000。拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可读出样品的吸光度 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。,分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离
10、心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。,使用分光光度计的注意事项,比色杯盛液量以达到杯容积2/3左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。一定要保证比色皿正确放入光路后再进行测量。一般应把溶液浓度尽量控制在吸光度值0.20.7的范围内进行测定。这样所测得的读数误差较小。如吸光度不在此范围内，可调节样品溶液浓度，适当稀释或加浓，使其在仪器准确度较高的范围内进行测定。,A样,A标,标准管中酚含量0.1mg/ml,稀释倍数,A样,A标,标准管中蛋白含量0.2mg/ml,稀释倍数,酶活性单位计算：,蛋白质含量计算:,比活性计算,AKP比活性=,每毫升样品的酶活性单位,每毫升样品的蛋白毫克数,纯化倍数=,每步比活性,初提液比活性（A液体）,总活力=酶活性单位体积,得率=,每步总活力,初提液总活力（A液体）,
